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醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用的研究

周勤虎  
【摘要】: 福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin-fixed and paraffin-embedded tissue,FFPET)因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本,因此在临床病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏,但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降解、DNA发生脱嘌呤以及DNA-蛋白质的交联,造成被固定组织DNA质量的改变,而且其在模板DNA中的残存也严重影响着PCR扩增。 研究表明,影响FFPET DNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取DNA的质量,从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件、增加循环次数或采用巢式PCR等,虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性,但并未明显改善其检出率;通过缩短扩增产物片段长度,如开发扩增片段较小的miniSTR (mini-short tandem repeat)系统或SNP (single nucleotide polymorphism)系统,虽然提高了对降解DNA检材的分型成功率,但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、伪峰等问题。此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的减小(基本在50-200bp之间);SNP分析技术要达到与目前所用STR试剂盒一样的识别率,所需的位点数较多等缺点,也限制了其在实际检案中的应用。 本研究基于法医学检案的实际需要,结合前人的研究成果,通过对醋酸铵盐析法进行改进,并结合PCR前修复技术提高模板DNA质量,以期为法医学实际检案中FFPET DNA的STR分型提供一种新的方法。 材料与方法 1、死后24h内尸体肾脏组织(1cm×1cm×0.5cm)及心血(15ml),均由中国医科大学法医病理学教研室提供。 2、经10%中性福尔马林溶液固定1d、3d、5d和7d后,进行石蜡包埋,常规切片备检。 3、血液DNA提取,新鲜组织DNA提取,FFPET切片DNA提取,对醋酸铵盐析法影响因素进行探讨,并将其与酚/氯仿法、Chelex-100法进行比较,同时探讨法医学可以实现成功分型的最小FFPET检材量。 4、对改良醋酸铵盐析法所提基因组DNA采用修复酶进行模板DNA的修复。 结果 1、不同脱蜡方法提取基因组DNA的PCR-PAGE结果显示未脱蜡和脱蜡均可得到清晰谱带;但是从谱带亮度上看95℃水浴脱蜡谱带最亮,65℃水浴脱蜡次之,后依次为二甲苯脱蜡、微波脱蜡、不脱蜡。 2、不同消化缓冲液消化提取DNA的PCR-PAGE结果显示0.5%Tween 20消化谱带最亮,1%Triton X-100消化次之,后依次为0.5%SDS消化,2%CTAB消化。 3、不同浓度醋酸铵溶液沉淀所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示三种浓度醋酸铵溶液提取的DNA量无显著性差异。PCR-PAGE结果显示三种浓度醋酸铵溶液提取的基因组DNA扩增产物均可得到清晰谱带,谱带亮度上三者之间无显著性差异。 4、不同固定时间FFPET所提基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果显示不同固定时间切片组织所提取的基因组DNA的电泳谱带均成弥散状,且随着固定时间的延长,谱带弥散越明显,谱带最亮区域逐渐下移。PCR-PAGE结果显示不同固定时间切片组织均可得到清晰谱带,但随着固定时间的延长,谱带亮度逐渐减弱。 5、不同提取方法所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示Chelex-100法所得DNA的电泳谱带最亮,改良醋酸铵盐析法次之,酚/氯仿法相对最弱;同一种方法内部比较显示随着检材量的减少,三种方法所提取的基因组DNA的电泳谱带亮度均逐渐减弱。OD260/OD280比值,改良醋酸铵盐析法在1.6~2之间(1.962±0.195),酚/氯仿法大于2(2.110±0.470),Chelex-100法在1左右(1.018±0.124)。从所得DNA的量上来看,Chelex-100法所得DNA的量明显高于其他两种方法;改良醋酸铵盐析法次之,酚/氯仿法最少;且随着检材量的减少,这种趋势更明显。PCR-PAGE结果显示改良醋酸铵盐析法提取的DNA均可扩增出清晰的谱带;酚/氯仿法提取的DNA扩增谱带较弱,且随着检材量的减少,谱带亮度明显减弱,当检材量减小为1/8片时已基本显示不出谱带;Chelex-100法提取的DNA在1片时未扩增出谱带,1/2片时谱带隐约可见,而在1/4片、1/8片时可见清晰谱带,但亮度不及改良醋酸铵盐析法所提取的DNA的亮度。 6、对改良醋酸铵盐析法所提取的模板DNA进行PCR前修复,PCR-PAGE结果显示采用Taq DNA聚合酶修复,修复组均扩增出清晰的谱带,而未修复组无谱带或谱带较弱;采用T4连接酶修复,修复组和未修复组在谱带亮度上未见显著性差异;采用Taq DNA聚合酶和T4连接酶联合修复,结果显示两个样品的修复组均可见清晰谱带,而未修复组均未见谱带。 结论 1、改良醋酸铵盐析法具有简单、经济、无毒等优点;与酚/氯仿法、Chelex-100法相比,提取基因组DNA的量更大、质量更好,适合微量检材DNA的提取。 2、使用Taq DNA聚合酶修复技术可以极大地提高高度降解检材STR分型的成功率,适合高度降解检材STR分型的应用。 3、改良醋酸铵盐析法结合酶修复技术实现了微量FFPET检(0.5cm×0.25cm×7μm)STR的成功分型,在特殊生物性检材的个人识别中具有重要意义。


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