收藏本站
收藏 | 论文排版

人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究

李丽  
【摘要】: 目的 促进血管新生、改善微循环是治疗缺血性疾病如冠状动脉硬化性心脏病、脑血管疾病和周围动脉闭塞性疾病的关键。“治疗性血管生成”是目前新提出的概念,其与传统的药物、介入外科手术等治疗手段不同,是通过模拟体内血管生成机制来达到促进血管新生,改善侧支循环的目的。其中种子细胞来源是血管组织工程的瓶颈,而内皮细胞(endothelial cells, ECs)是组织工程化血管中急需解决的种子细胞之一。目前已有研究者从不同干细胞分化ECs,如胚胎干细胞、胚胎的成血管细胞、内皮前体细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)和多潜能成体干细胞[4],但这几种细胞系在体内含量很少,且受各种因素限制不易获得。2004年,Oswald等人首次成功在体外诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向血管内皮细胞分化,因此,MSCs可能成为分化为内皮细胞理想的种子细胞来源。但人骨髓中的MSCs含量极低,大约1×104-1×105个单核细胞中含有1个MSC,并且在严重感染、骨髓恶性肿瘤或随着年龄增长的情况下,骨髓MSCs数量及增殖、分化能力均明显下降。2004年,Fukuchi等从成熟胎盘小叶中获得MSCs,后来证明胎盘来源的MSCs(placenta derived mesenchymal stem cells, PDMSCs)具有和骨髓来源的MSCs相似的形态学、免疫表型和功能特点。我们实验室也证明PDMSCs具有向脂肪、软骨、骨和神经分化的潜能。胎盘作为产后“废弃物”,对其研究不涉及伦理道德问题,且来源丰富。目前国内外尚未见PDMSCs向血管内皮细胞分化。因此,本实验将体外分离培养获得的PDMSCs经VEGF和bFGF体外诱导向血管内皮细胞分化,并在诱导过程中的不同时间点检测内皮特异性抗原的表达变化和分化的ECs在体外形成血管的能力,为临床上应用PDMSCs移植治疗缺血性疾病和构建血管组织工程提供实验依据。 方法 1、PDMSCs的分离、纯化和扩增采用组织块种植法提取原代,无菌条件下剪碎胎盘组织,然后均匀接种至10cm培养皿,加含10%FBS的DMEM1Oml,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,每3d换液一次,待细胞爬出生长至培养皿底部面积的70%-80%时去组织块传代,传2-3代,红细胞、成纤维细胞等混杂细胞即消失。本实验选取第3代PDMSCs进行诱导分化及检测。 2、流式细胞仪分析收集第3代PDMSCs,细胞计数后取各管为1×106细胞,滴加PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD105、CD34和FITC标记的CD166、CD31、CD45 20ul,分别设PE、FITC、空白对照组,4℃避光孵育30 min,冰PBS洗涤1次,弃上清,加入200 ul PBS吹打混匀细胞,流式细胞仪检测。 3、体外ECs诱导分化培养选择传代纯化后培养生长良好的第3代PDMSCs,调整细胞浓度为3×104cells/ml和1.5×1O5cells/ml分别接种于35mm培养皿和60mm培养皿中,加内皮细胞诱导分化培养基,置于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,每4d换一次新鲜诱导液。 4、光镜下观察PDMSCs形态变化在光学倒置显微镜下观察PDMSCs诱导后形态学变化、增殖情况及排列方式,对比0d、4d、8d、12d的变化。隔天观察一次。 5、免疫细胞化学染色以3×104cells/ml密度接种于35mm培养皿中,加诱导分化培养基培养,分别于分化第0d、4d、8d、12d用免疫细胞化学染色法检测内皮特异性标志CD31、CD144/VE-cadherin、KDR、vWF的蛋白表达情况。弃去培养基,PBS洗3遍4%多聚甲醛固定30min,滴加一抗,4℃孵育过夜,滴加二抗,37℃孵育30min。显微镜下观察拍照。 6、透射电镜观察细胞超微结构诱导后的细胞用0.25%Trypsin-EDTA消化后,1%锇酸固定,O.lmol/L PBS漂洗三次,酒精、丙酮梯度脱水:30%酒精-50%酒精-70%酒精-80%丙酮-90%丙酮-100%丙酮。环氧树脂浸透、包埋,超薄切片70nm。JEM-1200EX镜下观察并拍照。 7、体外血管生成实验用体外血管生成试剂盒,观察在半固体Matrix上诱导7d的细胞形成毛细血管样网状结构的能力。将Matrix置于4℃融化,24孔板每孔铺200ul ECMatrix,37℃、5%CO2的培养箱孵育2h,将诱导7d的PDMSCs以5×104/孔接种到半固体培养基上,2h后开始在倒置显微镜下观察细胞形成管状结构的形态。 结果 1、PDMSCs的原代培养结果胎盘组织块接种后,约7d-10d组织块周围可见梭形和小圆形两种贴壁细胞。随着细胞密度的增加,细胞逐渐变成梭形单层细胞,呈漩涡状排列,胞体变得大而扁平,形态类似于成纤维细胞。约14d-21d,细胞生长至70%-80%去组织块传代培养,传代细胞稳定生长。 2、流式细胞仪检测第3代PDMSCs高表达MSCs的表面标志CD105(92.87%)和CD166(72.40%),不表达造血系统特异标志CD34和白细胞共同抗原CD45,也不表达内皮细胞特异的表面标志CD31。 3、细胞形态学和排列方式观察在倒置和相差显微镜下观察,诱导分化的细胞形态呈鹅卵石样,且细胞排列具有一定方向性,呈管腔状、轮辐状、条带状生长,且细胞呈首尾相接连接在一起。 4、免疫细胞化学染色结果 (1)CD31在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,CD31在4d出现微量表达,但与Od相比无统计学意义(P>0.05),随着细胞不断分化,于分化8d CD31表达显著增强,明显高于0d、4d、12d(P0.05),12d表达减弱。 (2) VE-cadherin/CD144在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,CD144呈时间依赖性地表达于细胞与细胞之间的粘着小带,在诱导分化的Od和4d有微量表达,二者相比无统计学意义(P0.05),于分化8d和12d,细胞与细胞之间CD144阳性染色的棕黄色颗粒出现逐渐增多的趋势。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的8d和12d,细胞的积分光密度值(IOD)与其他三组有显著的统计学差异(P0.05),表明CD144可作为内皮终末分化的标志来鉴定成熟阶段的内皮细胞。 (3)vWF在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,vWF在0d有微量表达,4d表达增强,8d达高峰,之后稳定表达。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的8d和12d,细胞的积分光密度值显著高于Od和4d(P0.05)。 (4) Flk-1/KDR在ECs分化过程的表达变化Flk-1作为内皮细胞的早期标志,在Od即有表达,4d表达最强,随后表达降低。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的4d,细胞的积分光密度值显著高于0d、8d和12d(P0.05),0d、8d和12d三组间无统计学意义(P0.05)。 5、PDMSCs诱导的ECs超微结构透射电镜下观察诱导8d的细胞,可以看见内皮细胞典型的细胞膜穴样凹陷和吞饮小泡,胞浆中可见内皮特异性结构Weibel-palade小体。此外,胞浆中可见较多线粒体、高尔基体、粗面内质网和溶酶体等细胞器,提示细胞增殖分化旺盛,核膜和核仁清晰可见。 6、PDMSCs源的内皮细胞体外血管生成能力诱导7d的内皮细胞接种到细胞外基质凝胶(ECMatrigel)中,2h后相邻的细胞伸出触突彼此相连,并逐渐通过管状结构联成网状,5h-6h趋于典型,呈“毛细血管腔”样结构,而未分化的PDMSCs呈散在的细胞,不能形成管样结构。结论 1、胎盘组织中可以分离出大量的PDMSCs。 2、PDMSCs在体外可被诱导分化为血管内皮细胞,且分化的内皮细胞在体外具有迁移和血管形成能力。 3、在PDMSCs向ECs分化过程中,内皮特异性标志Flk-1/KDR、CD31、vWF和VE-cadherin/CD144的表达高峰呈一定时间顺序性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王燕,陈光辉,邵建华,田新利;大鼠脂肪组织源性间充质干细胞的分离及向心肌细胞的诱导分化[J];山东大学学报(医学版);2005年07期
2 吴金生;董爱萍;王晓萃;魏志新;刘伟光;栾志敏;祝增军;;骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤[J];中国实验动物学报;2010年01期
3 叶明珠;刘爱民;韩丽英;李荷莲;董玉洁;;人早期胚胎源性间充质干细胞的体外分离培养及其生物学特性[J];吉林大学学报(医学版);2007年04期
4 徐秋岚;王玲;苗宗宁;祝建忠;朱明月;;体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究[J];交通医学;2007年02期
5 王丽娟;;脐血间充质干细胞的研究进展[J];内蒙古医学院学报;2010年S3期
6 张近宝;顾春虎;刘维永;王云雅;卫向阳;欧阳辉;刘兴光;;犬骨髓间充质干细胞可诱导分化为组织工程瓣间质种子细胞[J];心脏杂志;2006年05期
7 祝建中;赵基栋;苗宗宁;钱寒光;;体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究[J];中国微循环;2005年06期
8 于瑾,王启伟,陈昭烈;间充质干细胞诱导分化为胰岛β细胞的研究进展[J];中国生物工程杂志;2005年08期
9 任红英;赵钦军;邢文;杨少光;卢士红;任倩;张磊;韩忠朝;;脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞[J];中国医学科学院学报;2010年02期
10 张卫泽;陈跃武;陈永清;哈小琴;马凌;秦勉;洪志斌;;体外定向化学诱导成人脂肪源性间充质干细胞分化为心肌样细胞[J];西北国防医学杂志;2006年05期
11 迟作华;陆琰;张洹;;高糖诱导人脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化[J];暨南大学学报(医学版);2007年04期
12 陆长富;;发育重演律与干细胞研究[J];自然杂志;2009年05期
13 唐文洁;李玛琳;洪岸;;间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展[J];中国科学(C辑:生命科学);2006年06期
14 向明章;蒋耀光;王慧春;林一丹;;人肺组织来源的间充质干细胞的分离和鉴定[J];重庆医学;2006年06期
15 王斌;洪小杨;杜江;朱德新;田兆方;封志纯;;人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性[J];实用儿科临床杂志;2006年10期
16 迟作华;张洹;陆琰;;脐血间充质干细胞的分离鉴定及其向脂肪和成骨的分化[J];基础医学与临床;2006年03期
17 杨艳;汪维伟;;间充质干细胞的可塑性研究现状[J];国际移植与血液净化杂志;2006年04期
18 于俊兰;徐迎新;李荣;;骨髓干细胞的肝细胞样细胞分化[J];医学综述;2005年12期
19 张文元;杨亚冬;房国坚;陈勇;;大鼠骨髓间充质干细胞的分离增殖及分化潜能活性[J];现代医药卫生;2006年06期
20 王蓓,汪维伟;间充质干细胞的研究进展[J];国外医学.外科学分册;2005年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨少光;池颖;戎丽娟;邢文;卢士红;赵钦军;马凤霞;韩忠朝;;不同来源间充质干细胞诱导分化成血管内皮细胞的比较[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
2 姜廷帅;蔡莉;惠延年;闫峰;;大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为角膜上皮细胞的实验研究[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年
3 李丽;马海英;马玲;于艳秋;;人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
4 白春雨;李方华;庞全海;关伟军;马月辉;;北京油鸡脐带间充质干细胞分离培养及诱导分化的研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
5 郭勇;张西正;郭春;魏严;李瑞欣;徐晓莹;张永红;;脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化中心肌发育相关基因的表达[A];天津市生物医学工程学会2008年年会暨首届生物医学工程与临床论坛论文集[C];2008年
6 朱恒;江小霞;刘元林;张毅;毛宁;;间充质干细胞选择性调节破骨细胞发育和功能[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
7 张颢;陶艳玲;邱林;张伯龙;马军;陈志哲;刘拥军;韩忠朝;;一种具有免疫负调节功能的人脐带源间充质干细胞[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
8 戴育成;;间充质干细胞的生物学特性和应用[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
9 马晓荣;张胜利;吴齐全;高同斌;周君梅;谢华;陈方;;应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外实验研究[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
10 张东辉;许永华;许琴;李建瑛;是文辉;李佳佳;卢开伯;邢彦超;于良宽;龙志新;;“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李东杰;人脐带间充质干细胞促进创面愈合及体外诱导分化为表皮样细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
2 熊卉;转化生长因子β1基因体外转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞向纤维软骨转化实验研究[D];武汉大学;2010年
3 朱雅姝;Flk-1~+间充质干细胞对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制研究[D];中国协和医科大学;2008年
4 苗宗宁;胎盘间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料在骨创伤修复中的实验研究[D];苏州大学;2010年
5 彭飞;620nm非相干红光对大鼠骨髓间充质干细胞的光生物调节作用[D];华中科技大学;2011年
6 于美娇;系统归巢的间充质干细胞在牙周组织修复再生过程中的作用研究[D];山东大学;2011年
7 李宝军;脂肪间充质干细胞体外诱导及复合PLGA体内异位成软骨的实验研究[D];中南大学;2007年
8 吴桂珠;脂肪间充质干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究[D];福建医科大学;2010年
9 李志勇;大鼠骨髓间充质干细胞牙向分化潜能的实验研究[D];四川大学;2005年
10 梁伟;人骨髓Flk-1~+间充质干细胞抗DNA损伤物质影响作用研究[D];中国协和医科大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李丽;人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究[D];中国医科大学;2010年
2 唐子滨;纳米级胶原基骨材料复合自体脂肪间充质干细胞用于兔后外侧脊柱融合的实验研究[D];河北医科大学;2010年
3 李敏;人脐带间充质干细胞三维载体接种方法的研究[D];兰州大学;2011年
4 张茜真;人脐带间充质干细胞的分离、鉴定以及干细胞特异性转录因子诱导其重编程的研究[D];浙江理工大学;2010年
5 黄伟;脐血源间充质干细胞生物学特性及其向神经样细胞分化的实验研究[D];苏州大学;2005年
6 汲晶;脂肪与骨髓来源的间充质干细胞诱导分化为神经细胞的比较[D];山西医科大学;2010年
7 陈义;脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究[D];暨南大学;2010年
8 张钰;体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究[D];中国医科大学;2008年
9 石丹;骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究[D];吉林大学;2007年
10 高志买;间充质干细胞高分子量分泌成分对辐射性肠损伤的修复作用[D];安徽医科大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王秋月 王琳;空军总医院采用间充质干细胞救治小脑萎缩[N];科技日报;2009年
2 记者 李素锋;我市首例间充质干细胞移植手术取得成功[N];临汾日报;2009年
3 记者 王丹 通讯员 艾素;异染性脑白质营养不良治疗获突破[N];健康报;2010年
4 记者 白毅;间充质干细胞可促进成熟树突状细胞增殖分化[N];中国医药报;2009年
5 通讯员 王根华 记者 陈青;诱导分化 让癌细胞“改邪归正”[N];文汇报;2008年
6 ;诱导分化让癌细胞有了“克星”[N];上海科技报;2008年
7 刘霞;诱导多功能干细胞“不忘”原初组织[N];科技日报;2010年
8 胡德荣;低氧环境诱导急粒白血病细胞系分化[N];健康报;2006年
9 中国医科院基础医学研究所 曾武威 章静波;从奥巴马松绑看干细胞热[N];健康报;2009年
10 白毅 顾伟民;黑暗中的一盏明灯[N];中国医药报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978