收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Tryptase诱导AML骨髓基质细胞高表达VEGF及机制的研究

杨秀鹏  
【摘要】: 目的 急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是血液系统常见的恶性肿瘤,以幼稚粒细胞克隆性增生且不伴有明显的分化为特征,临床分为多种亚型,大部分亚型的发病机制仍不十分清楚。类胰蛋白酶(Tryptase)是一种具有多种生物学效应的丝氨酸蛋白酶,目前被作为AML发病和临床监测过程中的一种新酶类而受到了人们的关注,以往被普遍认为主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞(嗜碱性粒细胞产生少量)产生的。随着对tryptase广泛和深入的研究,发现在AML患者的部分FAB亚型也高表达tryptase,同时,人们发现AML细胞系U937也可表达tryptase。但是,AML患者白血病细胞所分泌的tryptase在AML疾病发展中的作用目前仍不十分明确。 我们前期研究证实,AML-M2患者骨髓单个核细胞的VEGF与tryptase的表达均明显增高,且二者之间具有显著相关性。最近研究还发现,tryptase阳性的肥大细胞计数与许多恶性肿瘤和炎症的血管新生程度成正相关,可以促进多种肿瘤细胞和炎症细胞表达VEGF,并可作为判断恶性肿瘤患者预后的指标。这说明tryptase可能在AML血管新生中起着一定的作用,这种作用可能与VEGF有关,目前国内外尚未见相关报道。 PAR-2是tryptase的细胞表面受体,被tryptase酶切裂解后可介导跨膜信号转导,将细胞外的信号传递到细胞内。以往对多种细胞的研究表明,PAR-2可通过多种途径介导细胞内信号转导,但近年来研究主要集中在丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路,其中VEGF的表达则多与细胞外信号调节激酶ERK和p38MAPK通路有关。NF-κB是重要的转录调节因子,可作为ERK和p38MAPK信号通路的下游信号分子,被激活后可引起相应靶基因的转录激活,以往的研究表明VEGF的表达与NF-κB也有着密切的关系。 为探讨tryptase在AML血管新生中的作用,我们将研究tryptase作用于AMLBMCs后是否上调VEGF的表达,并进一步探讨tryptase促进AML BMCs表达VEGF的可能作用机制:tryptase与细胞表面的PAR-2作用后,依赖细胞内MAPK(ERK和/或p38MAPK)信号转导通路,激活转录调节因子NF-κB,使其转位到核内,促使VEGF表达增加。 方法 1、细胞培养及鉴定:骨髓肝素钠混合液5ml,加入10ml淋巴细胞分离液,2000rpm,离心10min,取单核细胞层,接种于25ml培养瓶中,15%胎牛血清,DMEM/F12中,培养箱常规培养。根据细胞形态学和流式细胞术检测细胞表面CD14,CD34,CD45,CD13和CD117表达情况,鉴定所培养的细胞为AML BMSCs。 2、重组tryptase与AML BMSCs共同孵育后检测VEGF的表达情况:以0-50ng/ml的tryptase作用于AML BMSCs,应用MTT的方法检测细胞活性,从而挑选tryptase的最佳作用浓度。以不同浓度(0.5,5,10 ng/ml)的tryptase作用于AML BMSCs,分别用ELISA、免疫荧光、real time RT-PCR和Western-blot的方法检测VEGF的表达情况。 3、以U937细胞的培养上清培养AML BMSCs,检测VEGF的表达:以DMEM/F12培养基、U937细胞培养上清液、U937细胞培养上清液加tryptase抗体作为培养基。培养AML BMSCs 24 h后,应用real time RT-PCR方法检测AMLBMSCs中VEGF mRNA的表达;培养AML BMSCs48 h,应用ELISA方法检测上清液中VEGF的表达情况。 4、免疫细胞化学和流式细胞术检测AML BMSCs表面PAR-2的表达:用胰酶将AML BMSCs从细胞培养瓶上消化下来,制成细胞爬片,待细胞生长至80%时,甲醛固定,以PBS作为阴性对照,免疫细胞化学方法检测PAR-2的表达。取AML BMSCs约106个细胞,甲醛固定,FITC标记的PAR-2冰上孵育1小时,PBS洗2次,以100μl PBS重悬细胞后上流式细胞仪检测。 5、Western blot检测tryptase处理前后ERK、p38MAPK蛋白:提取细胞总蛋白,上样量为20μg。转印到PVDF膜上后用5%脱脂奶粉封闭, ERK鼠抗人多克隆抗体(1:200)、磷酸化ERK鼠抗人多克隆抗体(1:200)及p38MAPK羊抗人多克隆抗体(1:200)、磷酸化p38MAPK鼠抗人多克隆抗体(1:200)育过夜,分别用相应的二抗室温孵育2 h,显色5min,于凝胶自动成像分析系统下成像,测定条带的平均积分光密度值。 6、EMSA检测tryptase处理前后NF-κB活化情况:AML BMSCs以PBS、tryptase、tryptase加NF-κB的阻断剂PDTC孵育24 h后,提取总的核蛋白,标记探针,加样,转膜,用X射线胶片曝光30 min,显影液5 min,定影液5 min。观察tryptase处理前后NF-κB的表达水平。 7、Real time RT-PCR检测使用PAR-2、ERK、p38MAPK和NF-κB特异性阻断剂预处理细胞后,tryptase诱导AML BMSCs表达VEGF mRNA的情况:分别使用PAR-2、ERK、p38MAPK和NF-κB特异性阻断剂:FLLSY-NH2 (200μM)、PD98059 (20μM)、SB230580 (10μM)和PDTC(100μM)孵育细胞30 min,然后tryptase与AML BMSCs共孵育24 h。收集细胞提取总RNA, real time RT-PCR检测VEGF mRNA表达。 8、Western-blot检测使用PAR-2、ERK、p38MAPK和NF-κB特异性阻断剂预处理细胞后,tryptase诱导AML BMSCs表达VEGF蛋白的情况:分别使用PAR-2、ERK、p38MAPK和NF-κB特异性阻断剂:FLLSY-NH2 (200μM)、PD98059 (20μM)、SB230580 (10μM)和PDTC(100μM)孵育细胞30 min,然后tryptase与AML BMSCs共孵育48 h。收集细胞提取总蛋白,Western-blot检测VEGF蛋白的表达。 9、统计学分析:统计数据以SPSS13.0软件进行分,计量资料用均数±标准差表示,组间比较用单因素方差分析,多个样本均数的两两比较用LSD方法。结果以P0.05认为差异有统计学意义。 结果 1、ELISA、免疫荧光、real time RT-PCR和Western-blot结果显示,tryptase作用于AML BMSCs后,与对照组相比VEGF表达明显增加(P0.05),且在一定浓度范围内,成一定剂量关系。 2、ELISA和real time RT-PCR结果显示,以U937细胞培养上清液、U937细胞培养上清液培养AML BMSCs后,与对照组相比/AML BMSCs中VEGF表达明显增加(P0.05),这种增加在使用了tryptase特异性抗体后明显减低(P0.05)。 3、流式细胞术和免疫细胞化学方法结果显示,AML BMSCs细胞表面有tryptase特异性受体PAR-2的表达。 4、Western blot结果显示,tryptase与AML BMSCs共同孵育48 h后,与对照组相比,磷酸化的ERK和p38MAPK蛋白表达明显增加(P0.05),在使用了磷酸化阻断剂PD98059和SB230580后表达降低(P0.05)。 5、EMSA结果显示,tryptase与AML BMSCs共同孵育48 h后,与对照组NF-κB核转位增加,在使用了NF-κB特异性阻断剂PDTC后表达降低。 6、Real time RT-PCR和Western-blot结果显示,分别使用PAR-2、ERK、p38MAPK和NF-κB特异性阻断剂(FLLSY-NH2、PD98059、SB230580和PDTC)处理细胞30 min后,tryptase上调AML BMSCs的VEGF mRNA和蛋白的表达明显减低(P0.05)。 结论 1、重组的tryptase可以促进AML BMSCs高表达VEGF,在一定浓度范围内呈剂量依赖关系。 2、白血病细胞系U937分泌的tryptase可以促进AML BMSCs高表达VEGF。 3、AML BMSCs表面表达PAR-2, PAR-2在tryptase上调AML BMSCs的VEGF表达中起着重要作用。 4、ERK、p38MAPK和NF-κB通路参与了tryptase上调AML BMSCs的VEGF表达。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;用PHA激活的淋巴细胞杀灭白血病细胞的体外实验[J];哈尔滨医科大学学报;1976年Z1期
2 范生尧;;白血病并发类似_(Landry)麻痹一例报告[J];泸州医学院学报;1980年02期
3 吴德沛;婴儿白血病细胞染色体特征的分析[J];国际儿科学杂志;1988年04期
4 陈智超!430022武汉,游泳!430022武汉,刘仲萍!430022武汉,喻冬娇!430022武汉,邹萍!430022武汉;白血病细胞在无血清体系中增生能力的探讨[J];华中医学杂志;1999年05期
5 包萃华;贺其图;;SDF-1/CXCR4轴与白血病血管新生研究进展[J];中国实验血液学杂志;2008年02期
6 肖平;曾耀英;聂燕芳;林蔚;吴晓萍;;骨髓白血病细胞蛋白质组双向电泳技术的建立与优化[J];中国实验血液学杂志;2008年03期
7 黄石兵;;急性髓系白血病患者血清VEGF的测定及意义[J];中国医药导报;2008年20期
8 ;可移植性小鼠肉瘤白血病(L759)的实验研究[J];遵义医学院学报;1980年03期
9 江裔发,潘瑞彭;神经氨酸酶与白血病的免疫治疗[J];国际输血及血液学杂志;1981年04期
10 孔宪寿,殷莲华,程立,梁子钧,陈依萍;小鼠L783白血病细胞特性的研究[J];复旦学报(医学版);1982年06期
11 吕桂云;关于成人T细胞白血病病因的研究[J];日本医学介绍;1982年11期
12 Rowley JD ,章静波;所有的白血病细胞都具有异常的核型吗?[J];国际遗传学杂志;1982年03期
13 薛建静,刘一农,王均衡;线粒体与白血病 Ⅱ.人白血病细胞线粒体超微结构的分析[J];哈尔滨医科大学学报;1985年03期
14 余海仁;;急性T细胞白血病后期发生ph~1染色体[J];国外医学.内科学分册;1985年09期
15 吴世华;;中西医结合治疗急性非淋巴细胞型白血病54例分析[J];中国中西医结合杂志;1985年09期
16 佟琳如,沈宜元,陈亚莉;小剂量阿糖胞苷缓解急性粒细胞白血病一例[J];青岛大学医学院学报;1986年04期
17 谭健;;预测白血病病人的治疗效果[J];国外医学情报;1986年20期
18 肖铮,于秉治,赵金星,侯伟健,张玉霞,王殿鸿;正常白细胞和白血病细胞中磷脂的分析及肌醇磷脂代谢[J];中国医科大学学报;1987年03期
19 达万明,刘源,韦树楠,魏世华;高热治疗白血病的研究——Ⅱ.正常造血细胞及白血病细胞对热杀伤敏感性的体外研究[J];西北国防医学杂志;1988年02期
20 白炎;朴鲜华;;用单克隆抗体清除人骨髓中白血病细胞的研究[J];临床血液学杂志;1988年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡欢开;刘彦信;郑德先;;TRAIL诱导白血病细胞凋亡过程中基因差异表达的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
2 陈信义;高智捷;刘江涛;李自全;王玉芝;;薯蓣皂甙体外抑制白血病细胞增殖研究[A];第六届全国中西医结合血液病学术会议论文汇编[C];2002年
3 钱文斌;金洁;童茵;徐伟来;;急性白血病患者白血病细胞端粒酶逆转录酶及端粒结合蛋白mRNA表达的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
4 殷红;陈子兴;岑建农;王玮;傅建新;姚利;;三丁酸甘油酯诱导白血病细胞增殖抑制、分化、凋亡及其机理的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
5 祝毓琳;张英;杨英;杜金伟;朱平;;常见白血病融合基因筛查在白血病诊断和分型中的意义探讨[A];第四届全国RNA进展研讨会论文集[C];2005年
6 岑建农;陈子兴;李振江;邱桥成;;骨髓间充质干细胞对白血病细胞的作用[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
7 谢晓宝;邱国强;盛立霞;;γ射线对白血病细胞B7分子、HLA抗原及抗原递呈能力的调节作用[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
8 王大刚;种靖慧;刘淑艳;马翠花;林永敏;吴克复;郑国光;;膜结合型干细胞因子在白血病细胞中的作用研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
9 兰志建;汤永民;宁铂涛;张玲燕;沈红强;钱柏芹;;采用Calcein-Am和流式细胞术评价白血病细胞膜P-gp泵功能及其意义[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
10 张群岭;张梅;贺鹏程;蔡瑞波;郭桂丽;关虹;刘亚琳;;白血病细胞多药耐药谱的表达特征与逆转耐药及预后关系的研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王钦红;细胞周期G1期调控分子在白血病细胞、淋巴瘤细胞以及CD34~+细胞增殖、分化、凋亡中的作用[D];复旦大学;2004年
2 宋满根;新型喜树碱衍生物NSC606985诱导白血病细胞凋亡的体内外研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
3 赵芳;表没食子儿茶素没食子酸酯单用及联合环孢菌素A或维拉帕米逆转白血病细胞多药耐药的实验研究[D];山东大学;2005年
4 靖彧;造血干细胞移植治疗急性髓系白血病CR1期的疗效分析[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
5 张鹏霞;齐墩果酸对人类白血病细胞的抑制作用及其机制的探讨[D];吉林大学;2008年
6 王伟佳;新的甾体类药物NSC67657诱导HL60细胞分化时关键蛋白的筛选、鉴定及其功能研究[D];重庆医科大学;2009年
7 张帆;共同抑制哺乳动物雷帕霉素靶复合物2和热休克蛋白90对白血病细胞的杀伤作用[D];中南大学;2012年
8 宋宁霞;小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响及机制探讨[D];第二军医大学;2010年
9 仇灏;β3-乙酰氨基葡萄糖基转移酶对白血病细胞分化的影响及其调控机制[D];苏州大学;2010年
10 陈静;白血病细胞多药耐药性的诱导及对三氧化二砷敏感性的细胞分子机制研究[D];兰州大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 乔斌;多烯紫杉醇诱导细胞凋亡与活性氧关系的研究[D];天津大学;2004年
2 翁春岚;GM-CSF-MA免疫脂质体靶向治疗人AML小鼠模型的实验研究[D];重庆医科大学;2007年
3 张翔;中药逆转白血病细胞多药耐药研究[D];扬州大学;2005年
4 于杜娟;联合应用三氧化二砷和TRAIL诱导白血病细胞株凋亡的实验研究[D];吉林大学;2007年
5 詹昱;FLOW-FISH联合检测白血病患者端粒长度及表面分化抗原的研究[D];南方医科大学;2008年
6 蔚利纳;HL-60白血病细胞诱导分化后NS基因表达变化与NF-κB和CyclinD1、A关联性的研究[D];郑州大学;2010年
7 盛立霞;DC-白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC诱导特异性T细胞应答的比较[D];苏州大学;2005年
8 古莹;氯原酸对白血病细胞的抑制作用及其作用机制的研究[D];浙江大学;2007年
9 宋宁霞;小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响[D];第二军医大学;2007年
10 宋洋;人参皂甙联合细胞因子诱导白血病细胞向树突状细胞分化的实验研究[D];大连医科大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 汪敏 仇逸;科学家提出低氧能够介导白血病细胞分化[N];中国高新技术产业导报;2003年
2 汪敏 仇逸;低氧能够诱导白血病细胞分化[N];新华每日电讯;2003年
3 汪敏 仇逸;低氧利于诱导白血病细胞分化[N];中国医药报;2003年
4 卢晶、余宁宁;我科研人员发现白血病“元凶”[N];人民日报;2005年
5 本报记者 顾介铸 本报通讯员 袁开建;创新,往往只是多问了句为什么[N];新华日报;2011年
6 市二院血液内科副主任医师 王智;治疗白血病贵在坚持[N];无锡日报;2006年
7 张乐 余宁宁;我国科学家找到白血病致病基因[N];大众科技报;2005年
8 米力汪;白血病细胞分化机理新理论[N];科技日报;2006年
9 卢勤;白血病细胞分化机制研究获突破[N];中国医药报;2004年
10 刘燕玲;中药有助解决白血病耐药性[N];健康报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978