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牙髓卟啉单胞菌内毒素对成骨细胞增殖和分化的影响

李任  
【摘要】: 目的 牙髓卟啉单胞菌(Porphyromomanus endodontalis, P.e)是牙髓根尖周病感染根管中的优势菌,为革兰阴性厌氧菌,其细胞壁外膜上的内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)是重要的毒力因子。在根尖周病的骨组织病变中,成骨细胞作用关键,既可分泌矿化基质形成骨组织,又可分泌炎症因子,促进破骨细胞的骨吸收作用。本实验旨在观察P.e-LPS对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)分泌情况的影响,探讨P.e-LPS在成骨细胞增殖与分化过程中的作用。 材料与方法 1、细菌培养 应用脑心浸液(Brain heart infusion,BHI)固体培养基在37℃、厌氧条件(含80%N2、10%CO2、10%H2)下复苏培养P.e,BHI液体培养基增菌后收集细菌,-20℃保存。 2、内毒素提取 采用热酚水法提取P.e-LPS,应用凝胶鲎试剂法对所提取内毒素进行定性分析。 3、细胞培养 小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)生长于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的MEM-a培养基中,置于含5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。选择生长状态良好的第3、4代细胞用于实验。 4、细胞增殖率检测 将终浓度为10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1细胞培养12h、24h、48h、72h,并设置未加P.e-LPS的对照组,MTT法于490nm波长处检测OD值。 5、ALP活性测定 将终浓度为10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1细胞6、12、24和48h,并设置未加P.e-LPS的对照组,ALP试剂盒于520nm波长处测OD值。 6、ELISA法检测IL-6 将终浓度为10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1细胞48h;根据剂量组结果,选择最佳浓度P.e-LPS作用细胞6、12、24、48h,并设置未加P.e-LPS组做对照,ELISA试剂盒于450nm波长处检测OD值。 7、统计学分析 所有实验数据应用SPSS11.0软件包建立数据库,进行单因素方差分析和Dunnett-t检验。显著水平:P0.05时有显著性差异,P0.01时有高度显著性差异。 结果 1、P.e-LPS作用于MC3T3-E1细胞,72h时25μg/ml组细胞相对增殖率(Relative growth rate, RGR)为87.464%,低于对照组(P0.05),50μg/ml组RGR显著为71.117%,显著低于对照组(P0.01)。 2、P.e-LPS作用6h时,各浓度的ALP活性的下降水平与对照组无显著性差异。当P.e-LPS作用12h时,50μg/ml组ALP活性下降与对照组有统计学意义(P0.05)。P.e-LPS作用24h后,各浓度组ALP活性均下降(P0.05)。 3、作用48h时,与0μg/ml组比较,10、25和50μg/ml组IL-6的分泌量均显著增加(P0.01),但50μg/ml组IL-6分泌量少于25μg/ml组。将25μg/ml组作用于MC3T3-E1后,与对照组相比较,在6h时IL-6表达有所增加(P0.05),随着作用时间延长,IL-6表达显著增加(P0.01)。 结论 1、P.e-LPS使MC3T3-E1细胞ALP活性降低,抑制了MC3T3-E1的分化; 2、在P.e-LPS长时间毒力刺激作用下,MC3T3-E1相对增殖率也显著下降。


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