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β-榄香烯对大鼠骨髓来源内皮祖细胞分化及分化过程中Notch信号通路的影响

孟晓  
【摘要】: 前言 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)是一类参与循环增殖并能分化为血管内皮细胞(endothelial cells, EC),但还未能表达成熟血管内皮细胞表型、也未形成微血管的前体细胞。胎儿出生后,EPC主要定居于骨髓。随着对EPC研究的深入,越来越多的证据表明EPC在肿瘤血管生成中起到重要作用。EPC分化为内皮细胞(endothelial cell, EC)是其功能发挥过程中的关键环节。 目前对EPC分化的研究主要从形态和细胞表面标志两方面入手。在形态学无法将EPC与其他细胞区分开来,所以主要靠分子标志识别。CD133是新近发现的干细胞标记,不表达于成熟EC,被认为是目前区分血管EPC与EC的最主要标记。vWF(von Willebrand因子)贮存在EC的Weibel-Palade小体中,血浆中vWF绝大部分系由EC分泌,它是血管内皮的分子标志物。研究结果表明,纯化的CD133+细胞在体外能分化为EC。在分化过程中,EPC明显失去CD133,并开始表达成熟EC特有的表面标志,如vWF。 Notch信号通路是进化过程中保守的信号通路,在决定细胞命运和模型建立中起到关键的作用.胚胎发育中,Notch信号通路是神经系统,心血管系统,免疫系统,肝脏和肾脏发育中的关键信号。成年后,Notch通路涉及组织再生和干细胞功能的发挥。 β-榄香烯是从姜科植物温郁金(温莪术)的根茎中提取的抗癌有效成分,温莪术在祖国医学中有行气破血,消积止痛、抗肿瘤的功效,它在诱导肿瘤细胞凋亡、分化、抗肿瘤转移、逆转肿瘤细胞的耐药性、降低肿瘤微血管密度等诸多方面都发挥着显著的作用。目前,临床上主要将榄香烯乳剂应用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的化疗,对白血病、恶性淋巴瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌亦有一定疗效。但其对EPC分化过程的影响尚待进一步研究。 实验方法 一、大鼠骨髓来源的EPC分离、培养及鉴定 应用梯度密度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,接种于内皮细胞培养液中,经血管内皮生长因子(1μg/μl VEGF)诱导后,进行细胞特异性标记物CD133、vWF相关抗原检测,鉴定其为内皮祖细胞。 二、EPC分化过程Notch信号通路的活化情况 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同培养时间(0天、4天、7天、10天、14天)EPC中Notch信号通路靶基因Hey-2、Hes-1的表达情况。 三、p-榄香烯对EPC分化及EPC分化过程中Notch信号通路的影响 (1)以不同浓度p-榄香烯(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20gg/ml)干预培养4天和7天的EPC,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测EPC表面抗原CD133、vWF的表达情况。 (2)以不同浓度β-榄香烯(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)干预培养7天的EPC,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Notch信号通路中靶基因Hey-2及Hes-1的表达情况。 实验结果 一、EPC的培养与鉴定 原代培养24h后,细胞大部分呈小圆形;差速贴壁筛选后,培养1d可见少量细胞贴壁;4d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形;7d有细胞集落形成,梭形细胞继续保持贴壁状态,生长旺盛;大约14d融合成内皮细胞单层典型的铺路石样形态。CD133、vWF双阳性荧光染色为正在分化的EPC。 二、EPC分化过程中Notch信号通路的活化情况 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同培养时间(O天、4天、7天、10天、14天)EPC中Notch信号通路靶基因Hey-2、Hes-1的表达情况。Hey-2、Hes-1在0天时无表达,4天有弱表达,7天、10天、14天表达逐渐增强,对灰度值的相对比值进行分析表明,p0.05。三、β-榄香烯对EPC分化及EPC分化过程中Notch信号通路的影响 1、p-榄香烯对EPC分化的影响在培养4天和7天的EPC培养液中加入不同浓度p-榄香烯(0gg/ml、5μg/ml、10gg/ml、20gg/ml),作用24小时后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测EPC表面抗原CD133和vWF的表达情况。结果表明,随着p-榄香烯浓度的增加,CD133表达逐渐增加,vWF表达逐渐减弱。对灰度值的相对比值进行分析表明,p0.01。 2、β-榄香烯对EPC分化过程中Notch信号通路的影响在培养7天的EPC培养液中加入不同浓度β-榄香烯(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml),作用24小时后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Notch信号通路中靶基因Hey-2和Hes-1的表达情况。结果表明,随着β-榄香烯浓度的增加,Hey-2和Hes-1的表达逐渐减弱。对灰度值的相对比值进行分析表明,p0.01 结论 在EPC分化过程中,有Notch信号传导通路的参与。 β-榄香烯对EPC的分化具有一定的抑制作用。 β-榄香烯对EPC分化过程中Notch信号通路有一定的阻断作用。


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