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加压培养对视网膜神经节细胞存活状态的影响

敖秀芹  
【摘要】: 青光眼是世界第二大致盲性眼病,视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的凋亡是青光眼发病的基本病理机制,眼内压升高是最重要的危险因素,但是眼内压引起RGCs凋亡的确切机制还不清楚。有研究表明遗传因素在青光眼的发病中起着重要的作用。OPTN基因是POAG确定的两个致病基因之一,研究证实其在细胞存活和凋亡中起到调控作用。本实验对RGC-5 (Retinal ganglion cell-5)进行加压培养,通过对不同压力培养条件下视网膜神经节细胞的生长存活率、凋亡情况及OPTN基因表达等指标的观察,分析不同压力培养条件下RGC-5细胞的活性和总体存活状态,从而初步探讨压力对视网膜神经节细胞的直接作用及影响。 方法 对传代培养的RGC-5分别给予0、20、40、60、80mmHg压力48小时,应用MTT方法和流式细胞学检测方法检测压力对RGC-5细胞存活率和凋亡的影响。应用免疫组织化学方法、Q-Real-time PCR和Western-Blot的方法检测压力作用下培养的RGC-5细胞OPTN基因的表达量。统计结果均以均数±标准差表示,各组间的比较用配对t检验分析方法,均用SPSS13.0软件进行统计分析。 结果 1、培养的RGC-5细胞呈梭型,平均分裂时间为2-3天左右,细胞生长旺盛。 2、MTT和流式检测结果显示在加压处理48小时后RGC-5存活率随着压力的增高逐渐下降,各组间差异有显著的统计学意义(P0.01);RGC-5细胞凋亡率不断增高,在40mmHg时以早期凋亡为主,60mmHg时以晚期凋亡为主,在80mmHg时细胞以死亡为主。 3、免疫组织化学检测结果显示各加压组平均积分光密度(Integrated optical density average,IODA)值为20mmHg组:(5.32±0.42);40mmHg组:(3.1±0.85);60mmHg组:(5.8±1.13):80mmHg组:(8.9±1.26);对照组:(10.58±1.45)。各加压组IODA值与对照组比较,均有统计学差异(P0.05);采用Q-Realtime-PCR定量分析,Gapdh作为内参,得出在20、40、60、80mmHg压力作用下RGC-5细胞内OPTN基因mRNA的表达量分别为对照组的0.12倍,0.04倍,0.35倍,0.48倍,各加压组细胞mRNA表达量与对照组比较均有统计学差异(P0.05);采用Western blot方法分析,Gapdh作为内参,得出在20、40、60、80mmHg压力作用下RGC-5细胞Optineurin蛋白表达量分别为对照组的0.91倍,0.79倍,0.86倍,0.96倍,20mmHg和80mmHg加压组与对照组比较无统计学差异(P0.05),40mmHg和60mmHg加压组与对照组比较有显著的统计学差异(P0.01) 结论 1、压力直接影响培养RGC-5的存活状态; 2、随绝对压力的不断增高,培养RGC-5细胞存活率不断降低,细胞凋亡和死亡趋见明显。 3、随绝对压力的不断增高,RGC-5细胞OPTN基因表达水平的V字形波动提示在不同压力条件下OPTN基因对培养视网膜神经节细胞的存活的调控作用可能不同,存在着细胞受损晚期的保护性作用可能。


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