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PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞增殖的影响

李丹  
【摘要】: 前言 后发性白内障是现代白内障手术后最常见的并发症,可引起视力的再次低下,又称后囊膜混浊(posterior capsular opacification, PCO)。白内障术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)发生增殖、迁移、纤维化生并伴随细胞外基质的分泌是PCO形成的主要原因,而晶状体上皮细胞的增殖最为关键。多年来国内外学者一直致力于通过药物等方法抑制晶状体上皮细胞增殖的研究。 目前,信号转导通路是细胞增殖机制研究领域的热点,PI3K/AKT(phosphati-dylinositol-3 kinase/AKT,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B)信号通路对细胞的生长、存活、增殖及凋亡均有重要调控作用[3],而LY294002作为该信号通路的特异性抑制剂,能够抑制细胞的增殖。S期激酶相关蛋白2(S phase kinase associated protein2,Skp2)作为该通路下游的靶调控因子,能够介导细胞周期因子降解而调控细胞的增殖。本研究应用PI3K抑制剂LY294002处理体外培养的人晶状体上皮细胞株SRA01/04,观察其对细胞增殖的影响及研究可能的相关机制,为临床后发性白内障的预防和治疗提供新的理论依据。 材料与方法 一、材料 人晶状体上皮细胞株SRA01/04由北京中国科学院肿瘤研究所提供。 二、方法 1、细胞培养,人晶状体上皮细胞株SRA01/04在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱内传代培养。 2、细胞分组,实验组加入25μmol/L的P13K抑制剂LY294002,对照组加入等体积DMSO。 3、应用噻唑蓝(MTT)比色法检测PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞增殖的影响,绘制生长曲线,筛选LY294002的最佳作用时间。 4、应用流式细胞术(FCM)检测PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞周期的影响。 5、应用Western-blot法检测PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞Skp2蛋白表达的影响。 6、应用实时RT-PCR法检测PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞Skp2mRNA表达的影响。 三、统计分析 实验数据采用SPSS 11.5统计学软件进行分析。各组数据以x±s表示,统计学分析应用t检验,P0.05认为差异有统计学意义。 结果 1、PI3K抑制剂LY294002抑制人晶状体上皮细胞的增殖 MTT法检测得出:实验组吸光度(A)值较对照组下降,差异有统计学意义(P0.05)。HLEC生长速率明显减慢,在12、24、36 h细胞生长抑制率分别为19.6%、33.8%和24.2%。 2、PI3K抑制剂LY294002阻滞人晶状体上皮细胞周期于G1/S期 FCM检测得出:实验组G1期细胞数(66.15+2.63)%与对照组G1期细胞数(56.73+1.35)%相比增多,差异有统计学意义(P0.05);而实验组S期细胞数(27.34+6.58)%较对照组S期细胞数(37.32+5.54)%显著减少,差异有统计学意义(P0.05)。 3、PI3K抑制剂LY294002抑制人晶状体上皮细胞Skp2蛋白表达 Western blot法检测得出:实验组细胞Skp2蛋白表达量明显减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。 4、PI3K抑制剂LY294002抑制人晶状体上皮细胞Skp2 mRNA表达 实时RT-PCR法检测得出:实验组细胞Skp2 mRNA的表达量降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。 结论 1、PI3K抑制剂LY294002抑制人晶状体上皮细胞株SRA01/04的增殖。 2、LY294002抑制细胞中Skp2表达,使部分细胞阻滞于细胞周期G1/S期。


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