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巨噬细胞衍生趋化因子在系统性红斑狼疮发病中的作用

刘海娜  
【摘要】: 目的 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种侵犯多系统的自身免疫性疾病,其特征为体内大量自身抗体的产生和免疫复合物的沉积,常累及肾脏引起不同程度肾实质和肾间质损害,其过程涉及多种炎性介质和细胞间复杂的相互作用。趋化因子对特异白细胞的趋化和功能活化是启动与自身免疫反应有关的病变的关键步骤之一。 巨噬细胞衍生趋化因子(macrophage-derived chemokine, MDC)作为Th2型CC亚类趋化因子能够引起树突状细胞、单核细胞和T细胞尤其是Th2细胞的趋化移动。MDC与CCR4受体特异性结合,与自身免疫性疾病发病和进展有密切的关系。为了评估MDC在系统性红斑狼疮发病中的和作用,我们对SLE患者血浆MDC含量进行了检测和分析。 有研究发现狼疮性肾炎病人肾组织中可见大量CD4+T细胞和单核巨噬细胞浸润,并有高水平的CCR4受体表达,提示其配体MDC和胸腺和活化调节因子(thymus and activation-regulated chemokine, TARC)可能也在LN病变过程中具有重要作用。在对于抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型的研究中,MDC抗体的应用减少了肾组织中单核细胞的浸润,并明显地缓解了新月体病变的产生。 我们利用SLE动物模型MRL/lpr小鼠,通过中和反应特异性阻断MDC活性,观察小鼠肾组织MDC和单核细胞分布及组织损伤的变化情况,检测MDC、TARC及CCR4受体mRNA和蛋白在组织中的表达,从而对SLE伴有肾脏损害时MDC在疾病进程中的地位和作用进行更加深入的研究并初步探讨MDC抗体在狼疮肾损害治疗中的价值和作用机制。 方法 1、ELISA法检测血浆MDC水平 分别选择SLE患者初治组26例、经治组20例,类风湿组患者16例,正常对照组16例。患者于清晨空腹采抗凝血2毫升离心处理后用于ELISA检测,建立标准曲线和空白对照管,待测品孔中每孔各加入待测样品100ul,按顺序加入一抗工作液、酶标抗体工作液、底物工作液和终止液,酶标仪492nm处测吸光度值,绘制标准曲线,计算MDC浓度值。 2、临床资料的采集 收集整理患者的临床及实验室检查资料、分析初治组26例患者中15例肾活检病理分型结果并按SLEDAI评分标准对每例SLE病人进行评分。 3、动物标本的采集 8周龄MRL/lpr小鼠8只,按照随机数表分成两组,白12周起分别给予300μl MDC抗体和PBS,隔日一次尾静脉注射,8周龄BALB/c小鼠4只作为对照,自12周龄起给予同体积PBS。分别于8周12周和16周采用代谢笼收集小鼠24小时尿量并用眶后静脉丛采血法采集血样。于16周龄脊髓横断法处死小鼠,取出一侧肾脏组织,用福尔马林固定后行组织病理学检查,另一侧肾组织用于RNA和蛋白提取。 4、肾组织常规病理学分析 福尔马林固定的小鼠肾脏组织脱水、石蜡包埋、常规组织切片,经HE和PAS染色,400×高倍视野光镜下观察肾小球、肾小管病理变化。 5、MDC和CD68免疫组织化学染色 切片脱蜡后正常山羊血清封闭20min,加1:100稀释的鼠抗鼠MDC/1:200兔抗鼠CD68,37℃孵育1小时,生物素化山羊抗鼠IgG/山羊抗兔IgG,37℃孵育20min,过氧化物酶标记的链酶亲和素工作液孵育20min, DAB染色,苏木素复染。400倍光镜下摄取图像并随机对选取视野内MDC和CD68免疫组化阳性信号进行图像分析,计算表达强度和细胞数。 6、RT-PCR法检测小鼠肾组织MDC、TARC和CCR4mRNA表达 Trizol试剂提取总RNA,取1μg样品RNA构建反转录体系合成cDNA。取逆转录产物进行常规PCR扩增。电泳结果用凝胶成像分析软件分析,记录每条DNA扩增带的灰度值,将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内对照β-actin扩增片段灰度值的比值作为每一个目的基因mRNA的半定量指标。 7、Western免疫印迹法检测小鼠肾组织MDC、TARC和CCR4蛋白表达 组织剪碎后加入配好的组织裂解液,匀浆机制成匀浆。12000rpm,4℃离心取上清用lowry法对蛋白进行定量。每份上清液取20μl加样,经SDS-PAGE凝胶进行蛋白分离后,转移至硝酸纤维素膜上,室温下封闭缓冲液封闭2小时,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1小时。用碱性磷酸酶显色法显示蛋白条带,凝胶图像分析软件分析。 8、统计学分析 统计结果以x±s表示,应用SPSS11.5软件对数据进行Mann-Whitney检验,Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon秩和检验、Spearman等级相关和Pearson相关系数分析,p0.05为有统计学意义。 结果 1、血浆MDC水平检测和分析 SLE初治组血浆MDC水平高于经治组、类风湿组和正常对照组。SLE经治组、类风湿组和正常对照组三组血浆MDC含量组间比较差异无统计学意义。15例LN病理类型分析,Ⅱ型和Ⅲ型狼疮性肾炎患者血浆MDC含量高于Ⅳ型。46例系统性红斑狼疮患者血浆MDC含量与对应的狼疮活动度评分SLEDAI分数呈正相关关系。 2、小鼠24小时尿蛋白量和血肌酐的测定 8周龄和12周龄时各组小鼠24小时尿蛋白量和血肌酐水平差异无统计学意义。16周龄时抗体干预组24小时尿蛋白量明显减少、血肌酐水平稳定,与MRL/lpr小鼠比较差异有统计学意义,而与BALB/c小鼠比较差异无统计学意义。 3、小鼠肾组织RT-PCR分析结果 对RT-PCR电泳成像结果进行灰度值测定,BALB/c小鼠肾脏组织中未检测到MDC、TARC和CCR4的表达,各组MRL/lpr小鼠肾组织可见MDC、TARC和CCR4的表达,抗体干预组MDC和CCR4mRNA表达低于MRL/lpr小鼠;MRL/lpr小鼠与抗体干预组小鼠肾组织TARCmRNA表达差异无统计学意义。 4、小鼠肾组织Western Blot分析结果 BALB/c小鼠肾脏组织中均未检测到MDC、TARC和CCR4的蛋白表达,抗体干预组小鼠肾组织MDC和CCR4蛋白表达水平低于MRL/lpr小鼠;MRL/lpr小鼠与抗体干预组小鼠肾组织TARC蛋白表达差异无统计学意义。 5、小鼠肾组织常规病理学检查 BALB/c小鼠肾小球血管袢薄而清晰,内皮细胞、系膜细胞和肾小管均正常;而MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,体积明显增大,肾小球囊腔狭窄,肾小管间质和肾小球内有炎症细胞浸润。抗体干预组肾小球及肾间质炎症细胞浸润较MRL/lpr小鼠明显减少。 6、小鼠肾组织MDC和CD68免疫组化染色 MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的炎症细胞胞质及间质基质均有MDC和CD68表达,以肾小管区域表达更为明显;抗体干预组小鼠肾组织MDC表达较MRL/lpr小鼠减弱;肾间质小管区域单核巨噬细胞浸润减少明显并与MDC面密度正相关。BALB/C小鼠肾组织MDC几乎无表达。 结论 初治SLE患者血浆MDC水平高于经治SLE患者、类风湿关节炎患者和正常对照组,SLE患者血浆MDC水平与24小时尿蛋白量、血肌酐和SLEDAI评分正相关。LN患者血浆中MDC含量与其病理类型存在明显的联系:Ⅱ型和Ⅲ型LN组高于Ⅳ型LN组。SLE疾病进程与血浆中MDC水平密切相关,提示MDC可能参与了SLE的发病和狼疮性肾炎病理损害的形成。 16周龄MRL/lpr小鼠出现肾脏功能学和形态学改变等LN相关表现;MRL/lpr小鼠肾组织可见MDC明显表达。BALB/c小鼠肾组织MDC无明显表达。MDC不仅在SLE患者外周血中水平增高,在狼疮模型小鼠的肾组织中也明显增高,说明MDC可能参与介导了MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的病变过程。 给予MDC抗体的狼疮小鼠肾脏功能和形态学上与无干预因素的狼疮小鼠相比较都有明显改善,抗体干预组MDC和CCR4mRNA和蛋白表达水平低于MRL/lpr小鼠。MDC在狼疮小鼠肾组织的高水平表达导致包括T细胞在内的单个核细胞在肾脏大量浸润可能是L N发生和进展的关键因素之一,MDC抗体通过抑制单个核细胞在狼疮小鼠肾组织的浸润,对肾脏损害有一定的缓解作用。


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