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黄体酮对大鼠急性脊髓损伤后水肿、AQP4和GFAP表达的影响

赵燕邦  
【摘要】: 脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后的脊髓水肿是脊髓继发损伤的关键病理生理过程之一,对预后影响较大。近年发现作为“神经甾体”的黄体酮(progesterone, PG)对中枢神经系统具有保护作用,在脑外伤及中风动物模型中能显著减轻脑水肿,提高神经功能恢复程度。人们对其治疗机理产生兴趣。目前,已普遍接受AQP4对中枢神经水肿起到主要的调节作用。AQP4主要在中枢神经系统星型胶质细胞表达。国内外对黄体酮减轻脊髓水肿机理的研究未见报道。 目的 1.观察大鼠急性脊髓损伤后及给与黄体酮后脊髓组织含水量的变化,验证黄体酮能否减轻脊髓水肿。2.观察大鼠急性脊髓损伤后AQP4和GFAP分布及表达量的变化。3.进一步观察给予黄体酮后AQP4和GFAP表达的变化,探讨黄体酮能否对AQP4和GFAP的表达产生影响。 方法 造模和取材:成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠144只,体重250-300g。随机分为三组。分别为:1、假手术+药用大豆油(溶媒剂)组(Sham+vehicle, SV组);2、脊髓损伤+药用大豆油组(Lesion+vehicle, LV组);3、脊髓损伤+黄体酮组(Lesion+progesterone, LP组)。每组内按时间点不同又分为0h,6h,12h,24h,48h和72h六个亚组,每组9只。每个亚组选3只大鼠进行灌注,固定。 采用钳夹法制作脊髓损伤模型。以T6棘突为中心,取后正中纵切口,长约3cm,暴露T5-T7的棘突,咬除T6棘突及全椎板,暴露脊髓硬膜约0.5cm长。调节自制脊髓夹的限宽为1mm。将脊髓夹的两个夹片分别插入脊髓硬膜与两侧椎弓根之间的间隙内。迅速夹两夹片至限宽,夹持时间约1分钟。观察到大鼠尾及双下肢出现痉挛、摆动时,证明大鼠脊髓损伤,迅速撤去脊髓夹。假手术组仅暴露硬膜。 LP组大鼠于术后0.5h腹腔内注射黄体酮,24h、48h皮下注射黄体酮,16mg/kg。SV组,LV组大鼠于术后0.5h腹腔内注射药用大豆油,24h、48h皮下注射药用大豆油(溶媒剂),16mg/kg。 利刀切取T4-5节段脊髓组织,测干湿重。利刀切取T7-8节段脊髓组织,仔细剥去硬膜,放入EP管内,迅速放入-70℃冷冻冰箱保存。 4%多聚甲醛左心室灌注。利刀切取T4-8节段脊髓组织将取出的大鼠脊髓放到事先准备好的4%多聚甲醛中固定,过夜,然后移至30%蔗糖中,4℃冰箱中进行充分脱水(3—7天),沉底。 检测方法 1:测干湿重比。2.HE染色观察光镜下脊髓损伤区水肿带的变化。3.免疫荧光双标法观察AQP4和GFAP表达分布的变化。4.Western blot法检测AQP4和GFAP表达量的变化。5.统计分析。 结果 1.脊髓组织含水量 SV组脊髓含水量最低,LP组较高,LV组最高。各组间比较有统计学差异。 2.HE染色光镜下观察 损伤组病灶区可分为血肿区、血肿周围区及邻近的正常组织区。出血区可见大量的红细胞,血肿周围有少量肿大的神经细胞,散在的炎性淋巴细胞。血肿内可见到坏死的和变性的神经细胞散在于大量的红细胞中,血肿周围可见水肿带;72h水肿最明显,血肿周围开始出现泡沫细胞,并可见周围组织疏松,形成周围明显的水肿带。 3.脊髓免疫荧光标记 假手术组及未损伤区的脊髓免疫荧光标记显示GFAP和AQP4在脊髓灰质,白质中均匀一致表达。AQP4在脊髓表面的软脊膜,脊髓实质内构成血脑屏障的小血管周围表达较多。AQP4在星型胶质细胞参与形成血脑屏障的足突上表达较多。与其他文献报道一致。 损伤后脊髓的GFAP和AQP4的双荧光共同标记显示二者的表达强度不一致,分布区域不一致。损伤后的GFAP荧光标记(绿光)显示LV组和LP组在短暂减弱后均明显增强,LP组增强的程度比LV组明显。损伤区与水肿区的移行部位增强表达明显。说明星型胶质细胞在损伤周围区明显增多。 损伤后的AQP4荧光标记(红光)显示LV组有增强趋势,LP组有轻度的下降趋势,损伤区与水肿区的移行部位未见表达。说明损伤周围区新增多的星型胶质细胞膜上没有AQP4表达。 4. Western blot测定 脊髓损伤对照组(LV组)AQP4在损伤后12、24、48、72小时与假手术对照组比较均明显表达增强(P0.01)。脊髓损伤治疗组(LP组)AQP4在损伤后12、24、48、72小时表达与假手术对照组比较有下降趋势(P0.05);与脊髓损伤对照组(LV组)比较损伤后6、12、24、48、72小时下降明显(P0.01)。 与假手术组(SM组)比较,脊髓损伤对照组(LV组)和脊髓损伤治疗组(LP组)GFAP在损伤后6、12、24、48、72小时均显著表达下降(P0.01),12小时下降到最低,24小时后恢复升高。;与脊髓损伤对照组(LV组)比较,脊髓损伤治疗组(LP组)在6、12、24小时表达无明显差异(P0.05):在48、72小时GFAP的表达明显增加(P0.05)。 结论 1.黄体酮能够降低急性脊髓损伤后脊髓组织的含水量,减轻脊髓水肿。 2.在正常脊髓上,AQP4与GFAP的表达分布均匀一致。AQP4在星型胶质细胞上表达,表达部位集中在参与形成血脑屏障的足突。在损伤区脊髓上,AQP4与GFAP的表达分布不一致,损伤区周围没有AQP4表达。 3.黄体酮促进脊髓损伤区周围大量反应性星形胶质细胞聚集。 4.黄体酮降低了脊髓损伤周围区AQP4的表达水平。


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