慢病毒介导TFAM/POLG基因knock-down小鼠的建立

【摘要】：目的 本课题以为研究表皮干细胞线粒体为新的切入点,通过体外构建miRNA分子表达载体,体外筛选干扰效率最高的重组慢病毒,通过卵周隙显微注射这一病毒建立基因沉默小鼠,并对小鼠进行检测,得到目标基因沉默小鼠模型,研究TFAM/POLG基因沉默下,表皮干细胞生物行为行为变化情况,为深入探讨ESC的增殖分化机制,提供新的理论依据。 方法 1、第一部分通过网站在线设计软件( http://katahdin.cshl.org:9331/ homepage/portal/Scripts/main2.pl),针对小鼠目标基因TFAM和POLG分别设计了三个条miR-shRNA分子序列;并通过DNA重组技术,以慢病毒载体FUGW为骨架,构建出miR30-based shRNA的重组慢病毒表达载体,并通过酶切鉴定与测序检测验证重组序列的准确性。通过“三质粒包装系统”,利用293FT细胞分别对上述重组慢病毒载体进行病毒包装,浓缩病毒悬液,制备出大于109的高滴度的重组慢病毒液;利用小鼠成纤维细胞进行病毒干扰效率的检测。 2、第二部分使用上述筛选出来的慢病毒载体并结合显微注射技术,完成了对卵周隙的病毒载体显微注射,培养出TFAM/POLG基因干扰的首建小鼠、并通过Western blot检测小鼠体内TFAM/POLG基因蛋白表达的干扰效果。 结果 1、通过荧光显微镜观察首建小鼠耳廓组织以后,可见eGFP特征性绿色荧光和RFP特征性红色荧光。在紫外线激发光下或红外线激发光下观察小鼠体表也可见荧光表达。 2、通过Western blot检测,显示首建小鼠的皮肤组织POLG为下调了62%、74%、60%、71%,而TFAM下调了72%、86%、70%、90%。 结论 通过重组慢病毒转基因系统,成功制备了特异性干扰TFAM/POLG基因的小鼠,证实了慢病毒介导的RNAi技术在制备基因干扰小鼠动物模型中的可操作性和高效性。为进一步研究线粒体功能状态和表皮干细胞的生物学行为之间的相互关系奠定了基础。