聚中性红修饰玻碳电极的制备及其在抗菌药物有效性检测中的应用

【摘要】：目的中性红是一种碱性吩嗪染料,由于其结构中存在氧化还原中心,因而可作为一种良好的媒介体使用。本论文以电聚合法制备聚中性红修饰玻碳电极(GCE),并以此修饰电极为电化学探针,考察代表性抗菌药物对埃希氏大肠杆菌(E.coli)的有效性,评估基于聚中性红(PNR)修饰GCE(PNR/GCE)的生物电化学体系应用于抗菌药物快速检测的可行性。在此基础上,以壳聚糖(CS)为成膜材料,石墨烯(GR)为导电纳米材料,通过制备生物复合纳米材料并直接修饰的方式制备GR/CS/E.coli/PNR/GCE。将最优条件下制备的GR/CS/E.coli/PNR/GCE应用于抗菌药物的有效性检测,考察构建的微生物电化学传感器用于抗菌药物有效性快速检测的可行性。方法以GCE为基体电极,采用电聚合法制备(PNR/GCE),运用循环伏安法(CV)对修饰电极进行表征,并以CV图中-0.45V处的氧化峰电流为指标,研究了中性红浓度、扫描段数、缓冲液p H值及支持电解质Na NO3浓度对聚合过程的影响,筛选了最佳聚合条件。继而借助中性红可作为电子媒介体的特性,以E.coli为模型微生物,通过考察E.coli活性与抗菌药物浓度的关系,构建一种新型体外药效检测方法,用于快速检测抗菌药物有效性。在此基础上,以CS为成膜材料,GR为导电纳米材料,将E.coli固定于PNR/GCE,得到GR/CS/E.coli/PNR/GCE。采用正交试验设计,对大肠杆菌的固定化条件进行筛选,并对正交试验结果进行方差分析,考察GR浓度、CS浓度和E.coli浓度三个因素对本实验的影响。将最优条件下制备的GR/CS/E.coli/PNR/GCE应用于代表性抗菌药物的有效性检测。结果(1)中性红浓度0.5 mmol/L,扫描段数Segment 30,缓冲液p H 7.0,Na NO3浓度0.5 mol/L为中性红最佳聚合条件。(2)菌悬液光密度值(OD600)0.5,反应时间40 min,以标准葡萄糖-谷氨酸溶液(GGA,BOD5为220 mg/L)为营养物质,此时抗菌药物有效性检测的灵敏度最高。(3)在最佳实验条件下,头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星四种抗菌药物对E.coli的半数抑菌浓度(IC50)分别为34.15 mg/L、27.98 mg/L、8.83 mg/L、11.49 mg/L;作为抗革兰氏阳性菌的万古霉素对E.coli的抑菌效果较差。(4)在PNR/GCE的基础上进行微生物固定化条件筛选。得出GR终浓度0.50 mg/m L,CS终浓度0.75%,E.coli终浓度0.50 g/m L为最佳微生物固定化条件。(5)将最优条件下制备的GR/CS/E.coli/PNR/GCE应用于庆大霉素、左氧氟沙星、头孢曲松钠、哌拉西林钠及万古霉素5种抗菌药物的有效性测定。前4种抗菌药物对E.coli的10%抑菌浓度(IC10)分别为15.81 mg/L、19.62 mg/L、65.74 mg/L、62.47 mg/L;而针对革兰氏阳性菌的万古霉素对E.coli基本无抑制作用。结论(1)采用电聚合法制备的PNR/GCE稳定性好、重复性好、灵敏度高。以PNR/GCE为工作电极,E.coli为模型微生物构建的生物电化学体系可用于抗菌药物有效性检测。相较于传统的药敏试验,此方法简便快速,可精确测得抗菌药物的有效率,因此可以作为检测抗菌药物有效性的传统方法的补充方法,在新型抗菌药物的研发和临床细菌耐药性检测方面具有一定的应用前景。(2)在最佳微生物固定化条件下制备的GR/CS/E.coli/PNR/GCE可用于抗菌药物有效性检测,具有一定的储存周期,避免了每次进行检测前都需要提前培养微生物的繁琐操作,有效减少了测试周期,在抗菌药物有效性检测和细菌耐药性监测方面皆有一定的应用潜力。