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P-选择蛋白对人单核细胞源性树突状细胞分化和免疫功能成熟的影响

李智  
【摘要】:背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种主要累及大中弹性动脉,以血管壁顺应性逐渐降低,管腔进行性狭窄或闭塞,最终导致组织或器官血液供需平衡失调为特点的慢性进展性疾病,严重威胁人类健康。有关动脉粥样硬化的发病机制仍然不是十分清楚。1999年,美国病理学家Ross提出炎症反应学说,认为AS是一种慢性炎症性疾病,得到学术界普遍认可。该学说认为AS发生发展过程中始终伴随着多种炎症细胞浸润。这些炎症细胞构成了动脉粥样硬化的炎性反应链。人们坚信最初斑块局部产生免疫应答启动是为了维持机体内环境的稳态,然而大量研究结果证实炎症不断放大的最终结果是促使动脉粥样硬化向不断发展的方向前行。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是跨越先天性免疫应答与获得性免疫应答之间的桥梁,在动脉粥样硬化炎症反应链中的作用不可忽视。 DCs是美国学者Steinmen和Cohn 1973年发现的,因为该种细胞成熟时表面具有很多树枝样的突起而得名。DCs是人体内功能最强大的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),它能够识别,摄取,加工和呈递抗原,快速致敏、激活并扩增初始型T细胞(naive T cell),使其克隆增殖,释放大量炎症介质,继而激活B淋巴细胞,启动获得性免疫应答,放大炎症反应。除此之外,DCs还能够诱导免疫耐受。近年来DCs在AS中扮演的重要角色,已经逐渐为人们所认知,并且展开了大量的研究。人们发现正常动脉内膜层和外膜层存在DCs等免疫活性细胞,组成血管相关性淋巴样组织(Vascular-associated lymphoid tissue,VALT),其功能类似于黏膜相关性淋巴组织,对微环境中潜在有害抗原进行免疫监视和筛查。随后人们发现AS局部有大量DCs浸润,并且进展期斑块中DCs的数量明显多于早期斑块。临床上冠心病患者亦存在DCs激活的证据。在急性冠脉综合征患者粥样斑块中DCs的数量超过稳定性心绞痛患者,并且DCs大多聚集在斑块比较容易破裂的肩部。因此人们推测DCs与斑块的稳定性密切相关。 在炎症反应中,粘附分子是介导炎症细胞渗出的的始动因素。P选择蛋白(P-selectin)是粘附分子中选择蛋白家族中的一员。P-selectin在DCs表面的主要配体是P选择蛋白糖蛋白配体-1(P selectin glycoprotein ligand,PSGL-1)。P-selectin与其配体(PS/PSGL-1)相互作用,能够活化血小板,介导DCs迁移,促进血栓形成,扩大炎症反应,加速AS斑块形成。临床研究发现,急性冠脉综合症患者血小板表面P-selectin表达明显高于稳定性心绞痛患者。因此人们推测P-selectin也与粥样斑块的稳定性相关。 目的:在离体水平观察P-selectin对DCs分化和免疫功能成熟的影响,并探讨其机制。 方法:我们从人外周血分离出单核细胞,联合应用100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4培养6天,将细胞分为四组:未成熟组(不加任何刺激因素)、脂多糖组(加入1ug/ml LPS)、P-selecin组(加入100ng/mlP-selectin)、P-selectin拮抗剂组(加入100mg/mlP-selectin和5ug/mlP-selectin拮抗剂),干预24小时后细胞备用。我们利用扫描电镜检测细胞形态变化,流式细胞技术检测DCs成熟标志的表达情况,混合淋巴细胞反应检测DCs免疫功能,RT-PCR检测细胞内TLR-4 mRNA表达情况。 结果:结果显示经P-selectin干预DCs具有典型树突样结构,细胞表面高表达CD1a、CD80、CD83、CD86,能够激活初始T淋巴细胞。RT-PCR证实P-selectin干预DCs TLR-4 mRNA的表达上调。试验进一步利用P-selectin拮抗剂干预P-selectin与DCs相互作用。P-selectin拮抗剂与P-selectin结构相似,能够竞争性抑制P-selectin与配体结合,抑制其生物学效应。我们主要采用流式细胞技术检测P-selectin与P-selectin拮抗剂组细胞表型的差异。结果显示:P-selectin拮抗剂组DCs表达CD1a,CD80,CD83,CD86四种抗原明显低于P-selectin组,但高于未成熟组。 结论: 1.P-selectin能有效促进DCs成熟,使其具有典型树突结构,上调表面标志物CD1a,CD80,CD83,CD86表达,激活初始T淋巴细胞使其克隆增殖。 2. P-selectin干预DCs内TLR-4 mRNA表达上调,推测DCs成熟的机制可能与核因子κB相关的信号转导通路有关。 3. P-selectin拮抗剂可以下调P-selectin组DCs表面标志物CD1a,CD80,CD83, CD86的表达。说明其介导的DCs成熟可以被P-selectin拮抗剂部分抑制。


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