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骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤移植途径的实验研究

赵学正  
【摘要】:目的:通过损伤局部直接注射法、股静脉注射法和腰椎穿刺法三种途径移植骨髓间充质干细胞到大鼠脊髓损伤部位,观察骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响,并比较、筛选适用于临床应用的移植途径。 方法: 1.取4只6周龄、体质量120-140g的健康SD大鼠,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,经过传代、扩增至第五代行流式细胞仪鉴定。在细胞移植前48小时进行Brdu标记,倒置相差显微镜下观察细胞形态。 2. 48只SD大鼠采用改良Allen’s打击法建立T10脊髓损伤模型,成功造模3天后随机分为四组。A组:模型对照组不行细胞移植;B组:直接注射组在脊髓损伤部位上下位点注射骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;C组:通过股静脉将骨髓间充质干细胞移植到损伤大鼠体内;D组:通过腰椎穿刺将骨髓间充质干细胞移植到损伤大鼠体内。在细胞移植后3、7、14、21天四个时间点进行观察。 3.用运动神经功能BBB评分观察大鼠后肢功能状态恢复的情况。 4.在各时间点取大鼠脊髓组织,观察损伤区病理学改变,并用免疫组化的方法检测各组Brdu阳性细胞、Brdu+GFAP、Brdu+NF-200双染阳性细胞,用专业图像分析软件计算各组GFAP、NF-200表达的平均光密度值。 5.统计学处理:实验数据以均数±标准差记录,使用统计学SPSS16.0软件进行单因素方差分析,以P0.05差异有统计学意义。 结果: 1.通过全骨髓贴壁法分离、培养的大鼠骨髓间充质干细胞在体外进行传代、扩增,第五代细胞形态呈长梭形,漩涡状排列,并且经过流式细胞仪检测证实分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 2. A、B、C、D四组大鼠后肢运动功能逐渐恢复,在细胞移植7、14、21天后B、C、D三组的运动功能BBB评分较A组明显增高,而且B组评分高于C、D两组(P0.01),D组运动功能评分高于C组(P0.01)。 3. HE染色结果显示,模型对照组脊髓组织有较多坏死区域,神经元大量坏死,空泡较多,间质水肿明显,而其它三个实验组的坏组织死较小,空泡少,间质水肿较轻。 4. B、C、D三组在细胞移植后均发现Brdu标记的阳性细胞,各时间点的B组细胞数目要显著多于C、D两组(P0.01),而且经腰椎穿刺移植的D组阳性细胞数要多于经股静脉移植的C组,差异具有统计学意义。在细胞移植后14天可以看到Brdu+GFAP双染阳性的细胞,而Brdu+NF-200双染阳性细胞出现在移植后21天,而且数量很少。使用专业图像软件分析得出:在细胞移植后GFAP和NF-200的平均光密度值都有增加,B、C、D三组与A组的差异具有统计学意义,而且三个实验组之前也有差异,B组的值高于C、D两组,D组要高于C组,差异有统计学意义(P0.05)。 结论: 1.用全骨髓贴壁法可以在体外分离和培养骨髓间充质干细胞; 2.直接注射、股静脉注射和腰椎穿刺三种途径移植的骨髓间充质干细胞均可在脊髓损伤处存活并可分化为神经元样细胞和星形胶质细胞,而且骨髓间充质干细胞有助于脊髓损伤神经功能的恢复; 3.通过三种移植途径综合评判和比较,细胞移植经腰椎穿刺途径要优于直接注射组和股静脉注射组,腰椎穿刺注射是一种袭性较小、较为理想的细胞植入方式,比较适合于临床应用。


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