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Hsp90/Raf-1及ERK通路在榄香烯诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用

赵永顺  
【摘要】:脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一,具有高发病率、高度侵袭性、高死亡率的特点。放化疗虽可部分抑制胶质瘤生长、缩小瘤体,但却无法彻底消灭所有肿瘤细胞,且胶质瘤常表现为较强的耐药性及辐射抵抗性;手术切除虽可以有效改善病情,但存在切除不彻底、易复发、并发症多等弊端,故临床治疗上十分棘手。近年来显微神经外科手术结合放、化疗是其治疗常规,因胶质瘤呈浸润性生长,瘤细胞易侵袭正常的脑组织,且胶质瘤的恶性程度随手术和复发次数的增加而增加。 榄香烯是从中药莪术中提取物,p-榄香烯是其主要成分,体内代谢产物为1-甲基-1-乙烯基-2-异丙烯基-4-异丙烯基环己烷;查阅相关资料显示:烷基化试剂具有可以诱导蛋白质错误折叠的特性;它是我国医药工作者自行开发的国家二类抗肿瘤新药,具有低毒、高效和广谱等优点。经过国内学者多年的研究,榄香烯对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用,已广泛应用于多种肿瘤的临床治疗中,如胶质瘤、多发脑转移癌、肝癌及白血病等。 近年来研究表明,榄香烯可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖、诱导胶质瘤细胞的凋亡。并且其抑制增殖作用与p38MAPK信号通路的活化及其上游信号的MKK3和MKK6之间的互补性活化密切相关。榄香烯诱导大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡而且其作用与Bcl-2蛋白表达的下调密切相关。但其诱导胶质瘤细胞凋亡的机制尚未完全阐明。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路主要包括:Extracellular signal-regulated kinases(ERKl/2), Jun N-terminal kinases (JNK)及p38MAPK通路;其中ERK1/2信号通路调控细胞生长和分化,是将胞外的生长和神经营养信号传到核内的蛋白激酶级联反应中的重要组分;JNK、p38MAPK信号通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。ERK1/2蛋白的输入信号中最重要的是生长因子受体来源的促细胞分裂信号,即Ras/Raf/MEK/ERK通路,而Bcl-2为ERK1/2蛋白的下游信号底物。 线粒体凋亡途径是利用线粒体作为核心成分去激活细胞凋亡,Bcl-2家族成员在调控线粒体介导的凋亡过程中是关键的调节因子,细胞内Bax/Bcl-2比值增加可以诱导线粒体向胞浆释放细胞色素c(cyt-c),形成凋亡小体活化Caspase-9,既而活化Caspase-3,最终Caspase-3-activated DNase(CAD)被激活,DXXD底物裂解,最终细胞凋亡。 多种蛋白包括分子伴侣Hsp90和14-3-3蛋白涉及Raf激酶活化过程调控。Ras-GTP的功能在于将Raf-1定位于其被激活部位的质膜,Raf-1的氨基酸调节结构域与Ras-GTP具有高亲和力,一旦Raf-1转到质膜上,其Tyr340和Tyr341将被膜结合酪氨酸激酶磷酸化而活化,活化的Raf-1足以激活ERK通路,Hsp90对于维持Raf激酶稳定和细胞内Raf激酶合适的定位非常重要。 Hsp90(Heat shock protein 90)是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一,许多信号转导蛋白的正常功能发挥都依赖于分子伴侣Hsp90, Hsp90与细胞内参与信号传递的许多重要分子形成复合体。依赖Hsp90发挥其功能的底物蛋白质被称为客户蛋白(client protein)。Hsp90的特点是通常与主顾蛋白质较为持续地形成稳定的功能性复合体,具有将蛋白质功能以特定构象稳定保持的作用。Raf-1即是Hsp90重要的客户蛋白之一。由于Hsp90的功能依赖于其严格的蛋白质空间三、四级结构,因此Hsp90很可能为榄香烯抗胶质瘤的作用靶点。p-榄香烯(致蛋白错误折叠的特性)使Hsp90空间构象改变、功能丧失从而阻断了其在Raf激酶活化过程中的重要作用。 目的:通过观察榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞、人源U87胶质瘤细胞Raf/MEK/ERK信号转导通路中各信号蛋白的活性、癌基因Bcl-2家族成员表达的影响及观察榄香烯对C6、U87细胞Raf/MEK/ERK通路中分子复合体Hsp90/Raf-1形成的影响,探讨其诱导胶质瘤细胞凋亡的相关机制,为榄香烯治疗胶质瘤提供理论依据和实验基础。 方法:通过采用细胞计数、流式细胞分析、免疫共沉淀、Western blot等方法分别检测不同浓度的榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞和人源U87胶质瘤细胞的增殖和凋亡影响,对C6、U87细胞Raf-1、ERK、Bcl-2、Bax等蛋白质表达的影响,对C6细胞、U87细胞Raf/MEK/ERK通路中与Raf-1结合形成分子复合物的Hsp90水平的影响;同时还观察榄香烯对接种U87胶质瘤细胞的裸鼠的肿瘤生长情况的影响。 结果:(1)榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的体外增殖抑制作用,榄香烯对C6胶质瘤细胞的增殖抑制效应呈剂量、时间依赖性,随药物浓度和作用时间的增加,抑制效应增强;(2)榄香烯呈时间依赖性诱导大鼠C6胶质瘤细胞和人源U87胶质瘤细胞的凋亡;(3)经榄香烯处理后,C6、U87细胞中与Raf-1结合并形成分子复合体的Hsp90水平下调(呈剂量依赖性),榄香烯阻碍Hsp90/Raf-1分子复合体的形成;(4)榄香烯下调C6、U87细胞中磷酸化的Raf-1和ERK蛋白表达(呈剂量依赖性);(5)榄香烯使C6、U87胶质瘤细胞中Bcl-2家族成员中Bcl-2表达下调(呈剂量依赖性),而对Bax表达无明显影响,使Bax:Bcl-2的比值增加;(6)通过腹腔注射榄香烯,可以抑制接种U87胶质瘤细胞的裸鼠的肿瘤生长。 结论:(1)榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的体外增殖抑制作用;(2)体外榄香烯呈时间依赖性诱导大鼠C6胶质瘤细胞和人源U87胶质瘤细胞的凋亡;(3)榄香烯诱导C6、U87细胞凋亡机制是:破坏Hsp90对客户蛋白Raf-1的分子伴侣功能,阻碍C6、U87细胞Hsp90/Raf-1复合体的形成,使Raf-1稳定性及空间构象受到破坏,与Ras-GTP具有高亲和力的Raf-1氨基酸调节结构域不能被暴露,Raf-1不能结合到Ras-GTP上进而被活化,抑制胶质瘤细胞赖以生存的Raf/MEK/ERK通路,下调ERK蛋白下游信号癌基因Bcl-2水平,增加Bax:Bcl-2的比值,启动凋亡程序,最终诱导C6、U87细胞凋亡;(4)榄香烯可以抑制U87胶质瘤细胞的体内增殖。


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