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β-榄香烯放疗增敏作用与乏氧及其分子靶点筛选的相关性研究

李国权  
【摘要】:β-榄香烯是从中药中提取的抗肿瘤有效成分,其放疗增敏作用已经得到肯定,但其放射增敏机制尚未完全阐述清楚,仍有诸多未知领域值得深入探索。 乏氧是实体肿瘤微环境普遍存在的现象,在乏氧状态下诸多相关基因发生转录和翻译,以使肿瘤细胞适应微环境的乏氧状态。目前乏氧细胞中研究最深入的转录因子是HIF-1,由α和β两个亚基组成,其中HIF-1α受氧的调节,HIF-1β与氧调节无关。Survivin是接受HIF-1α调节的重要分子,乏氧条件下HIF-1α可以直接连接到survivin的启动子,发挥正向调节survivin转录的作用。HIF-1α和survivin与肿瘤的放疗抵抗性密切相关,HIF-1α和survivin的高表达均预示患者放疗效果差及局部复发、总生存期减少等不良后果。因此,目前认为HIF-1α和survivin是增加肿瘤放疗敏感性和提高放疗疗效的潜在分子靶点。PI3K/AKT/mTOR通路是调节HIF-1α的蛋白表达的主要通路之一,而且也与放疗抵抗性密切相关。另外,近年来的实验研究还发现,survivin的表达通过mTOR途径调节。 既往的实验研究已经证实β-榄香烯的放射增敏机制主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、促使肿瘤细胞G-M期阻滞等方面,而survivin恰是在细胞分裂和细胞凋亡方面发挥重要的调节作用。HIF-1α是survivin转录的主要调解者,而HIF-1α与肿瘤的乏氧状态密切相关。β-榄香烯是否直接作用于HIF-1α-survivin这条通路,或者作用于HIF-1α上游的PI3K通路来调节HIF-1α的蛋白表达,进而改善肿瘤的乏氧状态,减少放疗抵抗性,达到放射增敏的目的,国内外未见有报道。β-榄香烯是作用于多靶点的新药,通过高通量的蛋白组学技术寻找β-榄香烯放射增敏的新靶点是切实可行的科学方法,对于阐明β-榄香烯的放射增敏机制具有重要的意义。 目的: 1.构建人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型;通过整体实验观察不同剂量β-榄香烯对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,确定适宜的增敏剂量;研究增敏剂量的β-榄香烯与放疗联合对于内源性乏氧标记物CAⅨ、外源性乏氧标记物-乏氧探针(Pimonidazole Hydrochloride)的作用。 2.β-榄香烯放疗增敏作用与乏氧关键分子HIF-1α及其下游的survivin以及细胞凋亡的相关性以及与HIF-1α上游的PI3K/mTOR通路的相关性研究,寻找β-榄香烯放疗增敏作用的新靶点。 3.应用荧光双向差异凝胶电泳(2D DIGE)蛋白质组学技术,对放疗组和联合组的移植瘤进行差异蛋白质的筛选,发现β-榄香烯放疗增敏作用的新靶点;应用RT-PCR和Western blot方法进行新靶点的验证。 方法:第一部分 1.采用细胞悬液接种法建立裸鼠移植瘤模型;将达到0.8~1.0cm~3瘤体积的裸鼠随机分组(每组5只):对照组(NaCl)、25mg/kg药物组、45mg/kg药物组、100mg/kg药物组、放疗组(NaCl+放疗)、25mg/kg药物+放疗组、45mg/kg药物+放疗组、100mg/kg药物+放疗组。腹腔注射β-榄香烯,对照组注射同等体积生理盐水。与放疗联合时,β-榄香烯于放疗前1h腹腔注射。采用6MeV电子线照射,剂量为5Gy。 2.治疗后移植瘤体积倍增时观测结束,获得各组的生长曲线。计算各组的平均抑瘤率并对各组体积变化进行比较。根据不同的体积倍增时间,计算各组的增敏系数(EF),确定实验采用的增敏剂量。 3.采用增敏剂量的β-榄香烯,将瘤体积达到0.8~1.0cm~3的新裸鼠再次给予随机分组,每组5只,即:对照组(NaCl)、药物组(增敏剂量)、放疗组、药物(增敏剂量)+放疗组。24h后断颈法处死裸鼠,获得移植瘤组织。 4.应用免疫组化染色检测各组移植瘤CAⅨ及乏氧探针的表达。 第二部分 1.RT-PCR技术检测各组移植瘤HIF-1α、survivin、PI3K及mTOR的mRNA表达。 2.Western blot技术检测各组移植瘤HIF-1α、survivin的蛋白表达。 3.免疫组化方法检测各组移植瘤HIF-1α、survivin表达。 4.TUNEL方法检测各组移植瘤的细胞凋亡情况。 第三部分 1.采用2D DIGE蛋白组学技术,筛选放疗组、联合组的差异蛋白质。 2.采用RT-PCR和Western blot方法,对于差异蛋白质peroxiredoxin-1(Prx-1)进行验证。 结果:第一部分 1.成功建立裸鼠移植瘤模型,根据体积变化获得各组的生长曲线。在2~8d之间,25、45和100mg/kg组的平均抑瘤率随剂量的增加而增加,说明β-榄香烯的抗肿瘤作用具有剂量依赖性。 2.各剂量组的EF值分别为0.84(25mg/kg)、1.24(45 mg/kg)、2.04(100mg/kg),说明45mg/kg和100mg/kgβ-榄香烯具有放疗增敏作用。但是100mg/kg直接抑制肿瘤作用过强,超过了单纯放疗组,而45mg/kg抑制肿瘤作用中等,因此下步实验研究采用45mg/kg作为放射增敏剂量。 2.各组CAⅨ表达情况:药物组与对照组比较表达增强(p0.05),放疗组与对照组比较表达略增强(p0.05),联合组与其它各组比较表达明显降低(P0.05)。 3.各组乏氧探针表达情况:药物组与对照组比较差异不大(p0.05),放疗组与其它各组比较表达明显增强(p0.05),联合组与其它各组比较表达明显降低(P0.01)。 第二部分 1.各组HIF-1α和survivin表达:药物组与对照组比较,二者的mRNA表达均增高(HIF-1α:p0.01;survivin:p0.05);药物组与对照组比较,二者的蛋白表达下降(p0.05)。放疗组与对照组比较,两者的mRNA和蛋白表达均增高(p0.01)。联合组与其余各组比较,明显抑制二者的mRNA和蛋白的表达(p0.01)。免疫组化表达结果:药物组与对照组比较,二者的表达差异不大(p0.05)。放疗组与对照组比较,明显增高二者的表达(HIF-1α:p0.05;survivin:p0.01)。联合组与其余各组比较明显抑制二者的表达(p0.01)。 2.TUNEL检测结果:药物组和放疗组与对照组比较,凋亡细胞比例明显增高(p0.05)。联合组与其它各组比较,细胞凋亡比例明显增高(p0.01)。 3.各组PI3K和mTOR的mRNA表达:药物组与对照组比较,PI3KmRNA表达水平无明显差异(p0.05);放疗组与对照组比较,PI3KmRNA表达明显增高(p0.01);联合组与放疗组比较PI3KmRNA表达水平差异不大(p0.05)。药物组和放疗组与对照组比较,mTORmRNA表达明显下降(p0.01);联合组mTOR mRNA表达基本检测不出。 第三部分 1.DIGE图像经软件分析,发现17个蛋白点表达量显著改变,其中联合组与放疗组比较有8个蛋白点表达量下降,其它9个蛋白点表达量上升。 2.表达差异的蛋白质通过质谱分析,并数据库检索,发现与放疗具有相关性的第780号蛋白质:peroxiredoxin-1(Prx-1)。 3.各组Prx-1mRNA的表达情况:药物组与对照组比较,Prx-1mRNA表达明显下降(p0.01)。放疗组与对照组比较,Prx-1mRNA表达明显提高(p0.01)。联合组与其余各组比较,Prx-1mRNA表达明显下降(p0.01)。 4.各组Prx-1蛋白的表达情况:药物组与对照组比较,Prx-1蛋白表达没有明显变化(p0.05)。放疗组与对照组比较,Prx-1蛋白表达明显提高(p0.01)。联合组与其余各组比较,Prx-1蛋白表达明显下降(p0.01)。 结论:第一部分: 1.成功建立肺癌A549细胞株的裸鼠移植瘤模型;通过观察肿瘤体积退缩程度及生长的延迟,发现β-榄香烯的直接抗肿瘤作用具有剂量依赖性。 2.根据各实验组的体积倍增时间,依据公式计算不同剂量水平的EF值,确定45mg/kg为适宜的增敏剂量。 3.增敏剂量的β-榄香烯促进移植瘤组织内源性CAⅨ的表达,对于外源性的乏氧探针表达影响不大,说明增敏剂量的β-榄香烯单独应用并不改善肿瘤组织的乏氧状态。 4.单纯放疗促进CAIX与乏氧探针的表达,说明单次放疗后24小时,肿瘤的乏氧状态加重,促进了肿瘤的放疗抵抗性。 5.β-榄香烯与放疗联合应用明显抑制内、外源性乏氧标记物的表达,提示二者联合可能通过改善肿瘤组织乏氧状态,达到放疗增敏的作用。 第二部分: 1.增敏剂量的β-榄香烯与放疗联合明显抑制移植瘤中HIF-1α和sur vivin的mRNA和蛋白水平的表达,提示HIF-1α和survivin是β-榄香烯放疗增敏作用的新靶点。 2.增敏剂量的β-榄香烯与放疗联合明显增加移植瘤组织的细胞凋亡,提示β-榄香烯通过抑制HIF-1α-survivin通路促进肿瘤细胞的凋亡。 3.增敏剂量的β-榄香烯对于移植瘤中PI3KmRNA表达没有作用,对于mTOR的mRNA表达有明显的抑制作用,与放疗联合显著抑制mTOR mRNA表达,提示mTOR可能是β-榄香烯增敏作用的潜在靶点。 4.单纯放疗诱导HIF-1α和survivin的mRNA和蛋白表达,但是对于mTOR mRNA表达明显抑制,提示放疗诱导HIF-1α和survivinm表达增高的机制主要由于放疗导致ROS的增高,引起的肿瘤的防御反应所致,而不是依赖mTOR途径调控。 第三部分: 1.应用2D DIGE蛋白组学技术,发现放疗组和联合组之间有17个蛋白点表达量显著改变,其中联合组与放疗组比较有8个蛋白点表达量下降,其它9个蛋白点表达量上升。通过质谱分析及数据库检索,发现差异蛋白:peroxiredoxin-1(Prx-1),其与放疗具有相关性。 2.药物组与对照组比较,Prx-1mRNA表达明显下降;但Prx-1蛋白表达没有明显变化,提示β-榄香烯与Prx-1的相互作用仍需继续深入研究。放疗组与对照组比较,明显提高了Prx-1mRNA和蛋白的表达,提示放疗诱导Prx-1的表达。 3.联合组与其余各组比较,Prx-1mRNA和蛋白表达均明显下降,提示Prx-1是β-榄香烯作用的新靶点。


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