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HCG对β1,4-GaITⅠ在调控胚胎着床作用中的影响及调控机制研究

陈丽丽  
【摘要】:哺乳动物胚胎着床包含子宫与胚胎之间一系列的同步协调的变化,是游离的胚泡与子宫内膜上皮细胞的识别、定位、黏附,进而植入子宫基质。成功着床依赖于子宫内膜接受状态的建立与胚泡侵入性的形成,即着床窗口期。着床窗口期在雌、孕激素的调解下子宫内膜分泌的大量细胞因子、黏附分子、蛋白水解酶等着床相关因子,介导胚胎与子宫内膜的识别、黏附,进一步调控胚胎着床的进程。 目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)作用下,模拟着床期子宫内膜细胞的子宫内膜癌细胞(RL95-2细胞)中β1,-GalTI表达水平变化及对胚胎和子宫内膜黏附的影响,并探讨与EGFR相关信号通路相关性;调控RL95-2细胞β1,4-GalTI的表达,检测相应基质金属蛋白酶MMPs及细胞外基质ECM表达变化,分析β1,4-GalTI对胚胎与子宫内膜黏附的影响,进一步探讨β1,4-GalTI调控胚胎着床的分子机制。 方法:构建体外着床模型,以人胎盘绒毛癌细胞(JAR细胞)模拟着床前胚胎,以子宫内膜癌细胞(RL95-2细胞)模拟着床前子宫内膜;改变子宫内膜环境人绒毛膜促性腺激素(HCG)的水平,免疫印迹、RT-PCR技术检测HCG对β1,4-GalTI表达的影响;免疫细胞化学染色分析HCG作用下β1,4-GalTI半乳糖基化的改变;RCA-1Lectin-blot技术分析HCG作用下Galβ1,4-GlcNAc糖链分支形成情况;检测HCG影响EGFR相关信号通路蛋白表达水平;分别通过荧光显微镜和流式细胞技术分析RL95-2细胞和JAR细胞间粘附的情况。 将β1,4-GalTI基因调控质粒(过表达质粒、干扰质粒)、干扰对照质粒和空质粒分别转染到RL95-2细胞中,采用免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹技术、免疫细胞化学染色等技术分别检测各组转染后细胞中β1,4-GalTI的表达情况以及对MMPs、ECM表达的影响;分别通过荧光显微镜和流式细胞技术观察β1,4-GalTI对体外着床模型RL95-2细胞与JAR细胞的粘附影响;RT-PCR技术检测HCG对β1,4-GalTⅠ及MMPs-TIMP-ECM通路表达影响。 结果:(1)子宫内膜细胞中β1,4-GalT-Ⅰ表达与HCG呈剂量、时间-效应关系,HCG最佳作用条件为5×10-4ug/ul、36h(P0.01);(2)HCG作用下明显上调EGFR、NF-κB、ICAM-1、EGF表达(P0.01);(3)HCG可促进JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用(P0.01);(4)子宫内膜细胞转染β1,4-GalT-Ⅰ基因调控质粒后,过表达组可明显上调MMP2、MMP9,并明显下调LN、TIMP-1,干扰组可明显下调MMP2、MMP9,并明显上调LN、TIMP-1(P0.01);(5)子宫内膜细胞转染β1,4-GalT-Ⅰ基因调控质粒后,过表达组可明显提高JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用,干扰组可使黏附作用下降(P0.01);(6)RT-PCR结果显示:HCG明显上调MMP2、MMP9表达,下调LN、TIMP-1表达(P0.01)。 结论:(1)HCG可调节子宫内膜细胞β1,4-GalT-Ⅰ的表达(呈现时间、剂量依赖关系),促进JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用;(2)HCG可调节子宫内膜细胞EGFR相关信号通路分子表达来调控胚胎着床。(3)调控β1,4-GalT-Ⅰ表达影响胚胎着床可能通过MMPs、ECM相关信号通路,进而调节JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用。(4)HCG可调节子宫内膜细胞MMPs-TIMP-ECM通路的表达来调控胚胎着床。


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