HCG对β1，4-GaITⅠ在调控胚胎着床作用中的影响及调控机制研究

【摘要】：哺乳动物胚胎着床包含子宫与胚胎之间一系列的同步协调的变化，是游离的胚泡与子宫内膜上皮细胞的识别、定位、黏附，进而植入子宫基质。成功着床依赖于子宫内膜接受状态的建立与胚泡侵入性的形成，即着床窗口期。着床窗口期在雌、孕激素的调解下子宫内膜分泌的大量细胞因子、黏附分子、蛋白水解酶等着床相关因子，介导胚胎与子宫内膜的识别、黏附，进一步调控胚胎着床的进程。 目的:探讨人绒毛膜促性腺激素（HCG）作用下，模拟着床期子宫内膜细胞的子宫内膜癌细胞（RL95-2细胞）中β1,-GalTI表达水平变化及对胚胎和子宫内膜黏附的影响，并探讨与EGFR相关信号通路相关性；调控RL95-2细胞β1,4-GalTI的表达，检测相应基质金属蛋白酶MMPs及细胞外基质ECM表达变化，分析β1,4-GalTI对胚胎与子宫内膜黏附的影响，进一步探讨β1,4-GalTI调控胚胎着床的分子机制。 方法：构建体外着床模型，以人胎盘绒毛癌细胞（JAR细胞）模拟着床前胚胎，以子宫内膜癌细胞（RL95-2细胞）模拟着床前子宫内膜；改变子宫内膜环境人绒毛膜促性腺激素（HCG）的水平，免疫印迹、RT-PCR技术检测HCG对β1,4-GalTI表达的影响；免疫细胞化学染色分析HCG作用下β1，4-GalTI半乳糖基化的改变；RCA-1Lectin-blot技术分析HCG作用下Galβ1，4-GlcNAc糖链分支形成情况；检测HCG影响EGFR相关信号通路蛋白表达水平；分别通过荧光显微镜和流式细胞技术分析RL95-2细胞和JAR细胞间粘附的情况。 将β1，4-GalTI基因调控质粒（过表达质粒、干扰质粒）、干扰对照质粒和空质粒分别转染到RL95-2细胞中，采用免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹技术、免疫细胞化学染色等技术分别检测各组转染后细胞中β1,4-GalTI的表达情况以及对MMPs、ECM表达的影响；分别通过荧光显微镜和流式细胞技术观察β1，4-GalTI对体外着床模型RL95-2细胞与JAR细胞的粘附影响；RT-PCR技术检测HCG对β1,4-GalTⅠ及MMPs-TIMP-ECM通路表达影响。 结果：（1）子宫内膜细胞中β1,4-GalT-Ⅰ表达与HCG呈剂量、时间-效应关系，HCG最佳作用条件为5×10-4ug/ul、36h（P0.01）；（2）HCG作用下明显上调EGFR、NF-κB、ICAM-1、EGF表达（P0.01）；（3）HCG可促进JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用（P0.01）；（4）子宫内膜细胞转染β1,4-GalT-Ⅰ基因调控质粒后，过表达组可明显上调MMP2、MMP9，并明显下调LN、TIMP-1，干扰组可明显下调MMP2、MMP9，并明显上调LN、TIMP-1（P0.01）；（5）子宫内膜细胞转染β1,4-GalT-Ⅰ基因调控质粒后，过表达组可明显提高JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用，干扰组可使黏附作用下降（P0.01）；（6）RT-PCR结果显示：HCG明显上调MMP2、MMP9表达，下调LN、TIMP-1表达（P0.01）。 结论：（1）HCG可调节子宫内膜细胞β1,4-GalT-Ⅰ的表达（呈现时间、剂量依赖关系），促进JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用；（2）HCG可调节子宫内膜细胞EGFR相关信号通路分子表达来调控胚胎着床。（3）调控β1,4-GalT-Ⅰ表达影响胚胎着床可能通过MMPs、ECM相关信号通路，进而调节JAR细胞对RL95-2细胞的黏附作用。（4）HCG可调节子宫内膜细胞MMPs-TIMP-ECM通路的表达来调控胚胎着床。