肝复康及XAV939对非经典Wnt/RhoA/ROCK信号通路的影响

【摘要】：目的：肝纤维化被认为是大部分肝脏慢性病变发展过程中必经的过程，并可进一步发展到肝硬化以至于肝癌。肝癌是我国高发的癌症之一，所以我国医学临床一直大力致力于肝癌的控制与干预。现今医学界普遍认为肝纤维化发展到肝硬化直到肝癌这一系列发展过程中纤维化到肝硬化是作为病变是否可逆的关键节点，即纤维化可逆而肝硬化不可逆。所以肝纤维化的干预与治疗在控制与预防肝硬化方面又有着重要作用。肝纤维化发展的核心是肝星状细胞的活化，大量研究证实Wnt信号传导通路参与肝纤维化的发展，根据不同的Wnt蛋白是否产生内源性β-catenin积累信号参与分为经典与非经典通路。其中Wnt经典通路（Wnt/β-catenin信号通路）多年来已有大量研究，而非经典Wnt信号通路中包含三条通路相对复杂且研究尚少。其中RhoA/ROCK信号通路参与多种疾病的发生，细胞的收缩、迁移、增殖、凋亡及基因的表达都有参与。小分子物质XAV939用于Wnt经典通路的干预已有研究证实其作用。但应用于肝细胞的研究还尚少。本此实验设计是把中药肝复康和小分子抑制剂XAV939干预肝星状细胞HSC-T6株，检测他们对致肝纤维化核心指标及非经典Wnt/RhoA/ROCK信号通路的影响与作用。来进一步研究探索经典Wnt信号通路与非经典Wnt信号通路间是否存在着相互联系。 方法：用DMEM培养基培养HSC-T6细胞，其中含有胎牛血清10%，放于温度为37℃，CO2含量为5%孵箱中，进行传代培养。等到细胞成对数增长时，用不含胎牛血清的DMEM，进行进行饥饿培养一天。 细胞于六孔板中随机分为：正常血清组（含10%正常大鼠血清的DMEM培养基）；XAV9391umol/L组（DMEM培养基中含10%正常大鼠血清并加入XAV9391umol/L）；XAV9392umol/L(DMEM培养基中含10%正常大鼠血清并加入XAV9392umol/L）；肝复康治疗组（含10%肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）。将六孔板放于孵箱中，温度为37℃，CO2含量为5%,培养两天。逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法测定细胞中collagen I，collagenIII，a-SMA，FAK，vinculin,RhoA,ROCKI的mRNA的表达;免疫蛋白印迹法（western blot）检测测细胞中ROCK1蛋白的表达。 结果： 1．肝复康及XAV939药物血清对细胞外基质（ECM）指标的影响 肝复康血清组相比正常血清组collagen I，collagenⅢ，a-SMA在基因水平表达均有明显的下降（P0.05)，XAV9391umol/L,2umol/L组相比于正常血清组collagenI，collagenⅢa-SMA在基因水平均有明显下降（P0.05)。并且XAV9392umol/L血清组作用效果强于1umol/L组。 2．肝复康及XAV939药物血清对细胞骨架改变指标的影响 肝复康血清组与正常血清组相比FAK,vinculin的mRNA水平表达均有明显的下降（P0.05)，XAV9391umol/L,2umol/L组FAK，vinculin的mRNA水平均有明显下降（P0.05)。并且XAV9392umol/L血清组作用效果强于1umol/L组。 3.肝复康及XAV939药物血清对RhoA/ROCK信号通路的影响 3.1RT-PCR结果显示XAV939血清组RhoA/ROCK信号通路的RhoA，ROCK1mRNA的表达相比于正常血清组均未出现显著变化，肝复康药物血清组RhoAmRNA的表达显著下调（P0.05)。 3.2Western-blot结果显示XAV939血清组RhoA/ROCK信号通路的ROCK1蛋白的表达相对于正常血清组均未出现显著变化，肝复康药物血清组中的ROCK1蛋白的表达显著下调（P0.05)。这与RT-PCR结果一致。 结论： 1.肝复康和XAV939对活化的星状细胞均有明显抑制作用。 2.肝复康对非经典Wnt RhoA/ROCK信号通路有抑制作用。 3.XAV939对非经典Wnt RhoA/ROCK信号通路作用不明显。