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丹酚酸B通过SIRT1对p53去乙酰化保护急性酒精所致的大鼠肝损伤

李明珠  
【摘要】:背景:急性酒精不仅会对肝脏产生一种急性的毒性影响,也对慢性酒精性肝病的形成起到了促进作用。有研究表明,SIRT1在酒精性肝病中发挥了重要作用,而其在急性酒精所介导的肝损伤中的作用未见报道。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是一种多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。已有文献证实丹酚酸B具有抵抗肝脏损伤的作用,但丹酚酸B是否能够通过调控SIRT1信号通路在急性酒精性肝损伤中发挥作用目前未见报道。 目的:研究丹酚酸B对急性酒精所致大鼠肝脏损伤的保护作用。从分子水平探索其作用与SIRT1相关通路之间的关系。 方法: 1、丹酚酸B对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究 将30只健康成年的雄性Wistar大鼠随机分为以下5组:(A)空白对照组;(B)丹酚酸B正常给药组(30mg/kg);(C)急性酒精肝损伤组(6g/kg);(D)低剂量丹酚酸B预处理组(15mg/kg);(E)高剂量丹酚酸B预处理组(30mg/kg)。检测大鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(AspartateAminotransferase, AST)、白介素6(Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α (tumornecrosis α, TNF-α)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的活性。光镜下观察各组动物肝脏石蜡切片的组织形态学变化。采用Western Blot法和RT-PCR法检测肝组织SIRT1、p53、acelyted-p53、PGC-1a、NF-κB、Bcl-xL、Cleaved caspase-3、MnSOD等蛋白水平以及SIRT1的基因表达水平。采用TUNEL法检测肝脏细胞的凋亡情况。 2、丹酚酸B对酒精损伤的HepG2细胞的保护作用及相关机制研究 (1)丹酚酸B对HepG2细胞酒精损伤的保护作用 HepG2细胞随机分成五组:空白对照组;急性酒精损伤组(200mM);低、中、高剂量丹酚酸B预处理组(0.5μM,2μM,8μM)。药物与细胞共同孵育3h。 (2)丹酚酸B对SIRT1蛋白表达的诱导作用 HepG2细胞随机分为四组:空白对照组;低、中、高浓度丹酚酸B预处理组(0.5μM,2μM,8μM)。药物与细胞共同孵育3h后,Western Blot法检测细胞内SIRT1的蛋白表达水平。 HepG2细胞随机分为四组:空白对照组;丹酚酸B(8μM)药物作用不同时间组(0h,1.5h,3h,6h)。药物与细胞孵育相应时间后,提取蛋白,采用WesternBlot法检测细胞内SIRT1的蛋白表达水平。 (3)丹酚酸B诱导SIRT1表达对p53乙酰化的调节作用 HepG2细胞随机分为四组:阴性对照组(si-Control);阴性对照+丹酚酸B组(8μM);转染SIRT1siRNA组;转染SIRT1siRNA+丹酚酸B组(8μM)。转染后,丹酚酸B给药作用3h后提取胞核蛋白。Western Blot法检测细胞内SIRT1及p53、acetyl-p53、PGC-1a的蛋白表达情况。 结果: 实验结果表明:急性酒精暴露会引起大鼠ALT、AST的水平上升,使大鼠血清中炎症细胞因子IL-6、TNF-α活性显著升高,同时大鼠肝组织中GSH、GSH-PX的活性明显下降,MDA明显上调。而在丹酚酸B预处理组中,这些现象明显改善。且丹酚酸B预处理可上调Bcl-xL蛋白表达,降低Cleaved caspase-3及NF-κB蛋白表达。更重要的是,丹酚酸B预处理显著上调了SIRT1的表达及活性,降低了乙酰化p53的表达。在细胞实验中,丹酚酸B对SIRT1的激活作用呈现一定的时间剂量依赖性,当SIRT1基因被干扰后,药物对SIRT1蛋白表达的激活及对乙酰化p53蛋白表达的抑制作用消失。以上结果表明丹酚酸B对急性酒精性肝损伤具有保护作用,并且这种作用是通过上调SIRT1的表达及其活性来实现的。 结论: 丹酚酸B可通过上调SIRT1的表达及活性,降低p53的乙酰化从而发挥其对急性酒精所致肝损伤及HepG2细胞酒精损伤的保护作用,推断此为其对抗酒精损伤的重要分子机制之一。


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