基于基因芯片和生物学分析技术对血管紧张素Ⅱ诱导的高血压急性肾脏损伤相关基因的研究

【摘要】：慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)是威胁人类健康的世界性难题,是导致终末期肾衰竭的主要原因。给与患者长期、合理的治疗,抑制或阻断导致肾脏损害进行性发展的各种途径,可以防止或延缓肾衰的发展,所以出现了大量进展性肾病相关机制的研究。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)是人体重要的体液调节系统,在维持血压以及体液和电解质平衡中起重要作用。RAAS成分既存在于循环系统中,也存在于心脏、血管、肾脏等组织中,参与介导高血压靶器官损伤。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)作为RAAS的主要成员,可介导血压水平的升高,使高灌注压作用于肾脏,进而导致肾脏的结构和功能发生病理性改变,而肾脏的病理性改变又可参与并维持高血压的发展。同时,Ang Ⅱ可通过其促炎、促纤维化作用,介导非血流动力学途径相关的肾脏损伤。大量研究证实,Ang Ⅱ可通过多种机制介导肾脏的炎症和纤维化。TGFβ1/Smad,Rho/Rho kinase和NF-κB是Ang Ⅱ介导肾脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和炎症细胞聚集的主要信号通路,阻断这些信号通路可显著抑制肾脏的炎症和纤维化进程。研究证实血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂(AT1 receptor blocker,ARB)可有效减缓高血压肾脏损伤的进展,为高血压和肾脏疾病患者带来临床获益,但是ACEI和ARB的应用不能完全阻断肾脏损伤的进展。所以阐明Ang Ⅱ介导肾脏损伤的具体分子机制对于肾脏疾病的早期有效干预以及预后的改善具有重要意义。基因芯片可检测生物全基因组基因表达水平的改变,近年此项技术已被广泛用于心血管及其他疾病相关的重要基因的筛查。因此,基因芯片分析将有助于了解肾脏损伤相关的重要调控基因,并阐明angii介导高血压和急性肾脏损伤的确切分子机制。本研究中,我们将以angii介导的高血压急性肾脏损伤小鼠模型为基础,应用芯片检测技术及生物学分析方法查找相关的重要基因。目的:建立angii介导的高血压急性肾脏损伤小鼠模型,并以此模型为基础,应用基因芯片技术及生物学分析方法探讨参与angii介导肾脏损伤的重要基因、基因功能以及相关的信号通路。方法:1.angii(1500ng/kg/min)微量泵灌注小鼠1、3、7天,鼠尾套管无创血压监测。2.应用he染色、免疫组化mac-2染色、masson染色和pas染色,检测angii灌注1、3、7天及对照小鼠肾脏组织的炎症、纤维化及糖原沉积水平。3.应用genechipmousegenome4302.0array检测angii灌注1、3、7天及对照组肾脏基因的表达谱。4.利用rvm模型校正过的多重比较检验,比较angii灌注1、3、7天的实验组和对照组样本,计算基因表达差异的显著性水平(p-value)和误判率(fdr),以得到有显著意义的差异表达基因。以qpcr方法检测部分差异基因的表达水平,并对qpcr结果和芯片结果进行相关性分析,以验证芯片结果的可靠性。5.应用go分析方法对差异基因进行基因功能注释,利用fisher精确检验以及卡方检验计算得出差异基因功能的p-value和fdr,以筛选出差异表达基因所体现的显著性功能。6.基于kegg数据库,对差异基因进行传导通路相关分析,利用fisher精确检验和卡方检验评价信号通路的显著性,并利用fdr校正p值,从而找出具有显著意义的传导通路。7.通过stcanalysis得到主流基因的表达趋势,将表达趋势相似的基因归入同一个表达模式,并按照其显著性水平将各种表达模式进行有序排列。8.以5个最具显著性的表达模式所包含的基因为基础,建立动态共表达网络,以找出angii灌注过程中发挥重要调控作用的基因。9.应用qpcr方法检测angii灌注1、3、7天时部分基因的表达水平,以验证芯片结果的可靠性。结果:1.野生型c57bl/6小鼠的基础收缩压约100mmhg。angii灌注后第1天收缩压即明显升高至140mmhg左右,灌注3-7天血压维持在150-170mmhg。2.he染色显示,angii灌注小鼠肾脏中多形核细胞数量明显多于对照组。3.免疫组化mac-2染色示angii灌注使小鼠肾脏组织巨噬细胞数量增多。4.masson染色结果示,与对照组相比angii灌注1、3、7天肾脏组织胶原沉积面积逐渐增大。5.pas染色显示,angii灌注1、3、7天小鼠肾脏组织糖原沉积水平较对照组无明显变化。6.基因芯片检测结果显示,angii灌注后共有1,511个基因的表达水平在至少一个时间点上发生了显著变化。angii灌注1天组,共640个基因表达水平增高,434个基因表达减少;angii灌注3天组,有380个基因表达水平增高,277个基因表达减少;angii灌注7天组,有224个基因表达水平增高,190个基因表达减少。qpcr验证结果和芯片结果之间存在显著的相关性。7.go分析得出的重要基因功能包括:对于各种刺激的反应(如药物、营养、糖皮质激素、脂多糖、低氧、肽类激素、camp、机械刺激、乙醇、细胞因子、雌二醇、过氧化氢、寒冷、有机氮、胰岛素)、老龄化、器官再生、免疫反应、细胞粘附、代谢过程(包括脂质、脂肪酸、胆固醇、脂蛋白)、肾脏发育、血压调节、细胞过程(细胞增殖、分化)、离子转运等。8.信号通路分析显示,在angii灌注的肾脏中有93条通路发生了显著性变化。其中包括:代谢相关通路(包括pparγ、细胞色素p450、维生素a、氨基酸、脂肪酸、氮、脂质)、免疫炎症相关过程(包括细胞因子与细胞因子受体的相互作用、抗原处理和抗原递呈、自然杀伤细胞介导的细胞毒效应、趋化因子信号通路、脂肪细胞因子、白细胞的跨内皮迁移、toll样受体)、ecm和受体相互作用、ras、mapk、mtor、jak-stat、wnt信号通路以及凋亡通路等。9.基因表达趋势分析将1,511个差异基因划分为26种表达模式,其中no.19、21、8、22、6统计学意义最为显著,p0.001。no.19包含275个基因,在angii灌注1天时表达增加,3天7天时降低。no.21包含176个基因,angii灌注3天时表达增加,7天时降低。no.22包含的基因在angii灌注1、3、7天时表达水平持续性升高。no.8和no.6的基因表达变化趋势与no.19和no.21相反,在angii灌注1天或3天时降低,在之后的时间点表达水平升高。5种表达模式中,no.19的p值最小。10.动态共表达网络分析显示脂肪酸结合蛋白1(fattyacidbindingprotein1,fabp1)既在整个基因网络占据中心位置,又在k-core值最高的46个基因组成的小网络中占据中心位置。fabp1的degree值为63,说明fabp1可直接调控63个相邻基因的表达。同时fabp1的聚类系数为0.85,低于其他基因,说明在与其他基因的相互作用中,fabp1占主导地位。11.qpcr结果示fabp1、fgl1、rgn、ccdc69、bb144871、slc36a2、ottmusg00000008561,tmem30a、tmem25、fads3、plagl1、ace、acy1、hk2、hba-a1、fkbp5、bcl2l11的表达变化趋势与芯片结果相符合。结论:1.angii灌注可导致小鼠收缩压水平显著升高,可达150-170mmhg。2.angii灌注促进小鼠肾脏中炎性细胞聚集,多形核细胞、巨噬细胞数量明显增多。3.随angii灌注时间的延长,肾脏纤维化程度不断加重。4.angii灌注对肾脏组织的糖原沉积无明显影响。5.angii灌注使1,511个基因的表达水平发生了显著变化,随灌注时间的延长,差异基因的数量在逐渐减少。6.angii灌注相关的重要基因功能包括:对各种刺激的反应、老龄化、器官再生、免疫反应、细胞粘附、代谢过程、肾脏发育、血压调节、细胞过程、离子转运等。7.angii灌注相关的重要信号通路包括:代谢相关通路、免疫炎症相关过程、ecm和受体相互作用、ras、mapk、mtor、jak-stat、wnt信号通路、凋亡通路等。8.表达模式No.19包含的275个基因在Ang Ⅱ灌注1天时表达增加,3天和7天时降低,是Ang Ⅱ介导高血压急性肾脏损伤过程中最主要的表达变化模式。9.Fabp1在基因共表达网络占据中心位置,在Ang Ⅱ介导高血压急性肾脏损伤的过程中起重要作用。