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PCOS对卵巢及母胎界面生殖功能的影响及调控机制

郑琴  
【摘要】:一、目的生殖过程是一个极其复杂的事件,涉及多种组织器官,包括卵巢、输卵管、子宫内膜和胚胎等。正常胚胎着床需要经历4个过程,即卵细胞成熟、排卵、受精和胚胎着床。其中任何一个环节出现功能失调都可导致不孕。目前,不孕在育龄女性中发病率约10%-12%。不孕的原因包括多个方面,如排卵功能障碍(多囊卵巢综合征:PCOS)、输卵管堵塞、子宫内膜接受态不良和胚胎着床失败等,这些异常都会导致女性不孕或妊娠相关疾病的发生。多囊卵巢综合征是育龄女性常见的内分泌紊乱综合征,主要表现为稀发排卵或不排卵、高雄激素血症和卵巢多囊性改变,是导致女性不孕最常见的原因。卵巢是女性重要的生殖器官,可产生多种激素(孕激素、雄激素、雌激素、黄体生成素和卵泡雌激素等)和细胞因子(LIF等),在正常排卵、月经周期及胚胎着床过程中发挥重要作用。由于PCOS患者内分泌紊乱的异质性和临床表现的复杂性,临床诊断多以B超等影像学诊断为主,而缺乏诊断疾病的特异性血清学标志物。目前,PCOS治疗的主要是类固醇激素类药物和卵巢手术等,而类固醇激素类药物治疗常伴有很多副作用。因此,全面系统的分析PCOS发生过程中的分子变化,探究PCOS发病机制,寻找敏感特异的血清学标志物及非类固醇激素类治疗药物,对PCOS的临床诊断和治疗具有重要意义。PCOS及其生殖功能障碍与子宫内膜接受态和胚胎着床相关,该方面报道较少。成功的胚胎着床需具备2个条件:接受态的子宫内膜和发育成熟的胚胎。处于接受态的子宫内膜具有接受成熟胚胎植入的能力。发育成熟的胚胎可以黏附并侵入接受态的子宫内膜,完成胚胎着床。子宫内膜接受态的建立和胚胎着床受多种激素和分子表达及修饰调控。糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,由特定的糖基转移酶催化完成。其中,糖蛋白携带的岩藻糖化聚糖由岩藻糖基转移酶催化合成,受激素或细胞因子等的表达调控。岩藻糖基转移酶的表达变化可导致糖蛋白上岩藻糖基化修饰的改变,影响细胞功能。研究发现,蛋白质糖基化可调节卵巢功能、介导母胎界面的识别和黏附以及胚胎着床,在生殖过程中发挥重要作用。蛋白质糖基化改变可引起子宫内膜接受性降低或胚胎植入能力下降,导致妊娠失败,引起女性不孕。本研究通过临床样品、细胞和动物模型,探讨PCOS发生发展过程中,生殖激素-α1,3岩藻糖基化-uPAR在卵巢-子宫内膜-胚胎轴中的表达调控及与生殖功能的相关性,为PCOS的临床诊断、治疗提供新的理论依据。二、实验方法(一)生殖激素在PCOS中的作用及调控机制(1)孕激素对PCOS患者血清和卵巢颗粒细胞蛋白表达的调节作用1.蛋白芯片筛选差异表达的血清蛋白,ELISA和Western blot(WB)验证5种低丰度血清蛋白(EREG、inhibinβA、IDE、PDGF-D和KNG1)的表达,分析其与孕激素的相关性;2.CCK8、克隆形成实验检测细胞增殖能力,TUNEL、DAPI染色和WB检测细胞凋亡水平。(2)脱氢表雄酮下调尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)抑制卵巢颗粒细胞EMT的机制1.ELISA检测正常女性及PCOS患者血清中uPAR和睾酮水平,WB进一步验证,分析两者相关性;2.CCK8检测细胞增殖能力,Transwell检测迁移和侵袭能力,WB和明胶酶谱检测MMP2/9的表达和活性;3.显微镜观察细胞形态变化,Real-time PCR、WB和免疫荧光(IF)检测EMT标志物、uPAR、分泌型uPAR(suPAR)、PI3K/Akt和MAPK信号通路的激活;4.DHEA诱导PCOS大鼠模型,免疫组化(IHC)检测大鼠卵巢组织中uPAR、PCNA和EMT标志物的表达。(3)ANP促进NPRA/PGRMC1/EGFR复合物形成影响卵巢颗粒细胞增殖和凋亡功能的机制1.ELISA检测ANP和激素水平,Real-time PCR和IHC检测ANP表达,扫描电镜观察子宫内膜表面微绒毛,IF、Real-time PCR、WB和IHC检测NPRA/C和PGRMC1表达;2.ELISA检测细胞培养上清中睾酮、孕激素和雌激素水平,CCK8、克隆形成实验、WB和IF检测细胞增殖功能,TUNEL、DAPI染色和WB检测凋亡功能;3.免疫共沉淀和WB检测PGRMC1和NPRA表达,及PCNA和MAPK/ERK信号通路,IHC和WB检测PCNA和AP1(p-c-Fos和p-c-Jun)表达。(二)α-1,3岩藻糖基化对子宫内膜接受态形成的调控机制研究1.Real-time PCR检测血清中miR-200家族(miR-200a、miR-200b、mi R-200c、miR-141和miR-429)的表达,ROC曲线分析诊断价值,分析岩藻糖基转移酶IV(FUT4)和miR-200c的相关性;2.CCK8、克隆形成实验检测细胞增殖功能,扫描电镜观察细胞表面微绒毛,细胞黏附实验分析细胞黏附功能;3.软件预测mi R-200c与FUT4结合位点,双荧光素酶基因报告实验检测细胞双荧光素活性,Real-time PCR、WB和IF检测FUT4表达;4.免疫共沉淀和WB检测α-1,3岩藻糖基化(LTL、Le Y)以及Wnt/β-catenin信号通路;5.利用小鼠早孕模型,计算孕第9天小鼠胚胎着床数,Real-time PCR、荧光原位杂交和IF检测小鼠子宫内膜中miR-200c、FUT4、LTL和LeY表达,扫描电镜观察子宫内膜表面微绒毛和吞饮泡,IHC检测PCNA和Wnt/β-catenin信号通路。(三)uPAR分子促进胚胎着床的机制研究(1)胚胎滋养层细胞uPAR表达及在侵袭过程中的作用机制1.IHC、WB、Real-time PCR和IF检测uPAR表达;2.绒毛体外培养和Transwell检测细胞迁移和侵袭功能,明胶酶谱检测MMP2活性,WB检测TIMP1/2表达,CCK8检测细胞增殖功能,WB检测细胞凋亡功能和uPAR表达。(2)uPA/uPAR上调FUT4表达及促进滋养层细胞侵袭的作用1.IHC、WB和IF检测AP1表达和MAPKs信号通路;2.Real-time PCR、WB和IF检测uPAR、FUT4、LTL和LeY表达;3.EMSA和ChIP检测FUT4启动子与AP1的结合;4.Transwell检测细胞迁移和侵袭功能。三、结果(一)生殖激素在PCOS中的作用及调控机制(1)孕激素对PCOS患者血清和卵巢颗粒细胞蛋白表达的调节作用1.PCOS患者和正常育龄女性血清中孕激素和蛋白表达存在差异;孕激素、EREG、inhibinβA、IDE、PDGF-D和KNG1在PCOS患者血清中表达降低,孕激素与五种细胞因子变化呈正相关;2.孕激素上调卵巢颗粒细胞中EREG、inhibinβA、IDE、PDGF-D和KNG1表达;EREG和inhibinβA促进卵巢颗粒细胞增殖,并抑制凋亡。(2)脱氢表雄酮下调尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)抑制卵巢颗粒细胞EMT的机制1.PCOS患者血清中uPAR表达降低;2.DHEA通过抑制uPAR/suPAR表达和PI3K/Akt及MAPK信号通路的激活,抑制卵巢颗粒细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。(3)ANP促进NPRA/PGRMC1/EGFR复合物形成影响卵巢颗粒细胞增殖和凋亡功能的机制1.ANP在PCOS患者和PCOS大鼠中表达降低,ANP治疗后改善卵巢形态和功能;2.RU486通过下调PGRMC1表达抑制卵巢颗粒细胞增殖,并促进凋亡;3.ANP通过上调NPRA/C表达促进卵巢颗粒细胞增殖,并抑制凋亡;4.ANP通过促进NPRA/PGRMC1/EGFR复合物形成、MAPK/ERK信号通路和AP1激活,促进卵巢颗粒细胞增殖。(二)α-1,3岩藻糖基化对子宫内膜接受态形成的调控机制研究1.miR-200家族在不孕和流产患者血清中表达升高,而FUT4表达降低,miR-200c和FUT4在不孕症患者血清中表达呈负相关;2.miR-200c抑制子宫内膜上皮细胞增殖和黏附能力;3.FUT4是miR-200c的靶基因;4.miR-200c通过抑制CD44糖蛋白上的α-1,3岩藻糖基化和Wnt/β-catenin信号通路的激活,抑制子宫内膜上皮细胞增殖和黏附;5.小鼠体内实验证实miR-200c通过下调FUT4/α-1,3岩藻糖基化抑制子宫内膜接受态形成和胚胎着床。(三)uPAR分子促进胚胎着床的机制研究(1)胚胎滋养层细胞uPAR表达及在侵袭过程中的作用机制1.uPAR在正常妊娠女性胎盘绒毛和滋养层细胞中的表达高于先兆流产患者;2.uPAR siRNA抑制滋养层细胞增殖、迁移和侵袭;3.LIF通过上调uPAR激活PI3K/Akt信号通路,促进滋养层细胞侵袭。(2)uPA/uPAR上调FUT4表达及促进滋养层细胞侵袭的作用1.AP1在正常妊娠女性绒毛和血清中表达高于先兆流产患者;2.uPA/uPAR通过JNK信号通路促进p-c-Fos、p-c-Jun和FUT4表达;3.uPA/uPAR激活AP1活性,增加FUT4转录及表达,促进滋养层细胞迁移和侵袭。四、结论1.多囊卵巢综合征(PCOS)患者和正常育龄女性血清蛋白表达存在差异,孕激素上调EREG和inhibinβA表达,EREG和inhibinβA可作为低孕激素PCOS患者的潜在血清学标志物;2.脱氢表雄酮(DHEA)通过下调uPAR/suPAR表达,抑制PI3K/Akt和MAPK信号通路的激活,抑制卵巢颗粒细胞增殖、迁移、侵袭和EMT;3.ANP通过促进NPRA/PGRMC1/EGFR复合物的形成,激活MAPK/ERK信号通路和转录因子AP1,改善卵巢功能;4.子宫内膜接受态的形成与α-1,3岩藻糖基化有关;5.miR-200c通过靶向FUT4和CD44糖蛋白上的α-1,3岩藻糖基化,抑制子宫内膜接受态形成;6.miR-200c和FUT4可作为子宫内膜接受态的潜在标志物,以及不孕症诊断和治疗靶点;7.胚胎滋养层细胞有uPAR表达;8.LIF通过上调uPAR表达,激活PI3K/Akt信号通路,促进滋养层细胞增殖、迁移和侵袭;9.uPA/uPAR激活AP1,上调FUT4表达,并促进滋养层细胞侵袭。


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