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miR-19a在胶质母细胞瘤中的表达、生物学功能以及对下游分子影响的机制研究

任思阳  
【摘要】:背景:胶质瘤是临床常见的原发性恶性肿瘤,其高发病率、高死亡率、高复发率和低治愈率是它的显著特点,临床上即使采用了国际统一的标准化治疗方案,即手术尽可能清除病灶,辅以化学治疗(替莫唑胺等药物)和(或)放射治疗(分割和/或标准脑部放疗术),该疾病的中位生存时间仍低于15个月,且此方案对于高级别的胶质瘤患者的预后并未有明显的改善。目前随着生物技术的发展和对分子生物学、分子病理学和遗传学的研究的加深,越来越多的肿瘤治疗基因靶点和对预后有推断作用的分子标记,已经陆续被发现。miR-19a最早是在淋巴细胞白血病中被发现能够促进癌细胞的增殖,并增强其防御能力。近几年来,越来越多的研究发现,miR-19a在包括消化系统,呼吸系统,泌尿系统,免疫系统,血液系统及内分泌系统等肿瘤组织中,均有异常增高,这种表达的改变调控了肿瘤的增殖、侵袭和转移等功能。本研究旨在探索miR-19a在人类胶质母细胞瘤组织中的异常表达情况,它与肿瘤组织的增殖、侵袭和迁移能力的关联,对肿瘤患者的预后的影响,以及其调控下游靶基因的途径。为胶质母细胞瘤的治疗提供新的诊断和治疗的方法,为胶质母细胞瘤患者和神经外科医生带来新的诊疗思路。方法:1.miR-19a在人类胶质瘤组织中的表达情况及其与临床病理分型的相关性:(1)从大连医科大学附属第一医院神经外科收集自2014年7月至2017年7月之间被诊断为胶质瘤并收入院,手术治疗后病理诊断为胶质瘤的30例胶质瘤组织和15例正常脑组织标本,在液氮中运输,-80℃冰箱保存。随后根据WHO对胶质瘤的分级,整理收集到的标本资料,对其进行统计学分析,同时随访患者;(2)通过实施定量PCR技术检测miR-19a在正常脑组织和新鲜胶质瘤组织中表达的差异。2.体外实验,miR-19a在胶质母细胞瘤各细胞系中的生物学功能研究:(1)利用实时定量PCR技术检测各细胞系中miR-19a的表达水平,选取U87和U251进行后续实验,通过慢病毒进行转染,下调miR-19a的表达,建造稳定细胞系sh-miR-19a,再利用实时定量PCR技术检测转染效率。(2)通过CCK、平板克隆、划痕实验等技术比较实验组与对照组的细胞系在增殖和侵袭能力方面的差别。3.基因芯片技术,通过对对照组和敲低组的基因芯片分析,比较敲低miR-19a前后,细胞内相关mRNA的变化,挑选并检测最具有统计学意义的mRNA,经过分析确定为TET2,以此进行后续研究。4.体内实验,使用裸鼠成瘤实验:(1)在成功建立稳转细胞系之后,向6-8周大的裸鼠右侧腋下注射足够剂量的实验组和对照组细胞系,每日观察、测量并记录肿瘤生长情况和大小,以此来研究miR-19a对体内成瘤的影响。(2)免疫组化、实时定量PCR对体内肿瘤组织的TET2和miR-19a的表达情况进行检测。5.miR-19a介导TET2机制的研究:通过Western Blot技术检测对对照组、空转组和实验组的周期相关蛋白进行检测。结论:1.miR-19a在胶质瘤标本和胶质母细胞瘤细胞系中高表达。通过实时定量PCR技术,对临床收集的30例新鲜胶质瘤标本和15例正常脑组织标本,以及多种胶质母细胞瘤细胞系中miR-19a的表达水平进行测定,结果显示,相比较于正常脑组织,在胶质瘤组织中miR-19a的表达明显上升,p0.05。在胶质母细胞瘤细胞系中,miR-19a也表现出了高表达的状态,但各个细胞系之间,高表达的程度不完全相同,其中U87和U251中miR-19a上升最明显,因此选择这两个细胞系为后续实验的主要细胞系。2.miR-19a的表达水平与肿瘤的病理分型正相关。通过分析新鲜标本的临床数据,我们统计了各种因素与miR-19a表达水平的相关性,结果显示,女性患者为14例(46.7%),男性患者为16例(53.3%),P=0.98;年龄小于50岁的患者为17例(56.6%),年龄大于等于50岁的患者为13例(43.3%),P=0.868;肿瘤位于额颞叶的患者为22例(73.3%),肿瘤位于侧脑室的患者为3例(10%),肿瘤位于顶枕叶的患者为4例(13.3%),肿瘤位于小脑的患者为1例(3.33%),P=0.443;最大直径小于5cm的患者为12例(40%),肿瘤最大直径大于等于5cm的患者为18例(60%),P=0.596;Ⅰ级与Ⅱ级胶质瘤组织中所表达的miR-19a水平,明显低于Ⅲ级与Ⅳ级,(P0.05)。由此可以得知,miR-19a的表达水平与WHO临床病理级别成正相关。3.miR-19a对胶质母细胞瘤的增殖、侵袭和成瘤都有促进作用,通过划痕实验检测miR-19a对胶质母细胞瘤的迁徙能力的影响,结果显示,下调miR-19a的胶质母细胞瘤细胞系在相同时间内,向划痕内迁移的能力明显下降,第8和第16小时的宽度的P值小于0.05,具有统计学意义。通过平板克隆实验和CCK8实验来研究miR-19a对胶质母细胞瘤增殖能力的影响。CCK8结果显示,相比较于对照组,实验组从第二天起在酶标仪内对波长为450nm的光吸收率明显下降,在第三天P0.05,具有统计学意义。通过平板克隆实验,我们发现经过下调之后的胶质母细胞瘤细胞在相同条件下,增殖的速度和数量远远落后于对照组,经过统计学分析P0.05,具有统计学意义。在裸鼠成瘤实验中,两个细胞系分别分成对照组和实验组,种植肿瘤后,经过了一个月的饲养,实验组的成瘤体积明显小于对照组,通过测量瘤体的重量,经过统计学分析,证明P0.05,两组之间差异有统计学意义,说明miR-19a下调之后,会明显影响肿瘤的形成和增殖能力。4.下调miR-19a之后,TET2的表达明显上升。为了寻找miR-19a的下游靶基因,我们对两组细胞进行了基因芯片分析,得到了 351个表达上调的mRNA和315个表达下调的mRNA,其中TET2的表达上调,差异倍数为8.12,是差异最明显的一个mRNA。在miR-19a被下调之后,TET2的表达明显上升,说明二者之间应该存在某种拮抗作用,探明这个机制可以为研究miR-19a对胶质母细胞瘤甚至其他肿瘤的调控影响,提供新的研究方向。5.上调TET2对胶质母细胞瘤具有抑制作用。再次用慢病毒对胶质母细胞瘤进行转染,使TET2的表达上调,通过MTT实验,我们发现上调过TET2的细胞系,其细胞的活性大大下降,证明TET2对肿瘤细胞具有抑制作用。6.上调TET2表达量对U87和U251细胞凋亡相关蛋白表达的影响。通过蛋白质印迹分析,结果显示,上调的TET2可以促进神经胶质母细胞瘤中activated caspase-3和Bax蛋白质的表达,同时抑制Bcl-2基因的表达。此外,通过Bcl-2蛋白的定量数据与Bax标准化,数据结果显示Bcl-2/Bax的比率显著降低。7.上调TET2表达量显著降低U87和U251细胞内间充质相关分子。划痕实验的结果表明,上调TET2之后,U87和U251的细胞迁徙能力被显著抑制,经过进一步研究发现,TET2的上调促进了细胞内间充质相关分子(包括Snail、Slug和N-钙粘蛋白)的表达8.用上调的TET2表达量干预处理后的两种胶质母细胞瘤细胞系,细胞中p-AKT/AKT和β-连环蛋白/β-肌动蛋白的蛋白质表达比,均显著降低。结论:1.miR-19a在胶质母细胞瘤中高表达,其表达水平与胶质瘤的WHO病理分级及预后显著相关。2.下调miR-19a可以明显影响胶质母细胞瘤的增殖和侵袭能力。3.下调miR-19a可以明显影响胶质母细胞瘤在裸鼠体内成瘤的能力。4.下调miR-19a导致TET2的表达明显上升。5.TET2通过调控凋亡蛋白,和间充质相关分子,对肿瘤细胞产生了较强的抑制作用。6.TET2可以使p-AKT/AKT和β-连环蛋白/β-肌动蛋白的蛋白质表达比明显下降,从而抑制肿瘤。


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