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整合素β5在肝细胞癌中的生物学功能及机制研究

林志坤  
【摘要】:背景原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,据估计每年原发性肝癌的新发病例大约有60万例,其死亡率高,是第3大恶性肿瘤致死疾病。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的一种病理类型,占原发性肝癌的85-90%。目前,针对肝细胞癌的治疗方式主要包括手术切除、消融治疗、介入治疗、肝移植、放化疗、免疫治疗及靶向治疗等。但是由于肝细胞癌发病隐匿,确诊时往往已经失去最佳的治疗机会,其预后非常不理想,5年生存率只有18%。尽管随着外科技术及围手术期管理的飞速发展,肝癌患者已经获得更多治疗及延长生命的机会,但是肝癌切除术后的预后仍不尽如人意,其主要原因是肝癌切除术后的高复发率以及肿瘤发生肝内或肝外的转移,因而研究肝癌生长、侵袭及转移的分子机制,发现新的特异性的靶点,从精准医学的角度寻找新的肝癌治疗策略显得尤为重要。整合素是广泛存在于细胞膜上的一种跨膜糖蛋白,由18种α亚基和8种β亚基构成的异二聚体,与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相互作用激活相关的信号通路,能够调控肿瘤细胞的多种生物学行为,包括黏附、增殖、迁移、侵袭和分化等。整合素与某些癌基因具有显著的相关性,这让他们成为肿瘤靶向治疗的热点。整合素β5(integrinβ5,ITGB5)是一种常见的整合素β亚基,其只与αV亚基组成异二聚体发挥生物学功能。近年来,一系列相关的研究表明整合素β5的异常表达与多种疾病的病理过程密切相关。整合素β5在多种疾病中具有促进血管形成的作用,它还能够与内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGF2)相互作用对细胞的凋亡起到抑制。整合素β5还能够促进肿瘤细胞的迁移、侵袭以及转化生长因子(transforming growth factorβ,TGF-β)诱导下的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。2015年的一项研究表明,肿瘤外泌中的整合素β5能够主导恶性肿瘤肝转移的亲器官性,促使包括结肠癌、胰腺癌,胃癌等在内的恶性肿瘤发生肝转移。然而整合素β5在肝细胞癌中的功能及机制尚不清楚。本课题致力于探究整合素β5在肝细胞癌中的作用,为肝癌的诊断及靶向治疗提供新的思路。第一部分整合素β5在肝细胞癌中的表达及其与临床特征的相关性研究目的:明确整合素β5在肝细胞癌中的表达及其与临床特征的相关性方法:通过免疫组化技术检测组织微列阵芯片中肝细胞癌及癌旁组织整合素β5表达情况进行比较,并与临床特征做相关性分析。采用Western blot技术在5种不同的肝癌细胞系中检测整合素β5表达情况。利用细胞免疫荧光技术检测5种不同的肝癌细胞系中检测整合素β5表达情况及分布。结果:1.肝细胞癌中整合素β5高表达。2.整合素β5的高表达与肝细胞癌患者的年龄≥50岁、肿瘤大小5cm和临床III+IV期相关。3.整合素β5在具有低转移潜能的肝癌细胞系Huh-7中表达量相对最低,而在具有高转移潜能的肝癌细胞系MHCC-97L中表达量相对最高。4.整合素β5主要分布在细胞膜及细胞质中。结论:1.整合素β5在肝细胞癌中高表达。2.整合素β5的高表达与肝细胞癌患者的年龄、肿瘤大小和临床分期相关。3.整合素β5在肝癌细胞系Huh-7中低表达,MHCC-97L中高表达。4.整合素β5主要分布于细胞膜和细胞质中。第二部分整合素β5通过FAK磷酸化促进玻连蛋白介导肝癌细胞黏附的研究目的:明确整合素β5在玻连蛋白介导肝癌细胞黏附中的影响方法:分别在Huh-7、MHCC-97L、Bel-7402细胞系中应用慢病毒转染技术构建整合素β5稳定上调和下调细胞系。Western blot技术验证上调或下调效率。细胞黏附实验探究玻连蛋白介导下整合素β5对肝癌细胞黏附的影响。Western blot检测玻连蛋白介导下整合素β5对肝癌细胞黏附相关分子FAK,p FAK(Tyr397和Tyr925)水平的变化。PF-573228和Defactinib两种抑制剂处理稳转细胞,细胞黏附实验及Western blot技术验证FAK在整合素β5调节玻连蛋白介导黏附中的作用。结果:1.Huh-7、MHCC-97L、Bel-7402细胞系中的整合素β5被稳定下调或上调。2.玻连蛋白介导的黏附实验中,下调整合素β5的表达能够显著抑制肝癌细胞的黏附能力。上调整合素β5的表达能够显著增强肝癌细胞的黏附能力。3.在玻连蛋白介导肝癌细胞的黏附中,下调整合素β5能够显著降低p FAK(Tyr397和Tyr925)水平,上调整合素β5能够显著增高p FAK(Tyr397和Tyr925)水平,总的FAK水平均无改变。4.Bel-7402整合素β5稳定上调细胞系及对照组细胞系在玻连蛋白介导的黏附实验中,随着两种抑制剂的处理浓度的增大,细胞的黏附能力均逐渐减弱。5.在整合素β5调节玻连蛋白介导的黏附中,随着两种抑制剂的处理浓度的增大,p FAK(Tyr397和Tyr925)水平降低,总的FAK水平无明显改变。结论:1.整合素β5促进玻连蛋白介导的肝癌细胞黏附。2.整合素β5在玻连蛋白介导肝癌细胞的黏附中促进FAK的磷酸化。3.整合素β5通过FAK依赖方式调节玻连蛋白介导肝癌细胞的黏附。第三部分整合素β5调控β-catenin通路促进肝癌细胞增殖、迁移的机制研究目的:明确整合素β5对肝癌细胞增殖、迁移的影响及其机制的研究方法:采用克隆形成实验探究整合素β5对肝癌细胞增殖能力的影响。Transwell实验探究整合素β5对肝癌细胞迁移能力的影响。裸鼠皮下成瘤实验探究整合素β5对肝癌细胞成瘤能力的影响。质谱分析探究与整合素β5相互作用的蛋白。免疫共沉淀验证β-catenin与整合素β5相互作用的关系。Western blot技术检测整合素β5被上调或下调后,β-catenin蛋白水平的变化。q RT-PCR技术检测整合素β5被上调或下调后,β-catenin m RNA水平的变化。稳转细胞经过蛋白酶体抑制剂MG132或放线菌酮处理后,Western blot技术检测β-catenin蛋白水平的变化。体内泛素化实验检测稳转细胞中β-catenin的泛素化水平。双荧光素酶报告基因实验(TOPflash/FOP-flash)实验检测稳转细胞中β-catenin/TCL/LEF的转录活性。Western blot技术检测整合素β5被上调或下调后,β-catenin下游基因Cyclin D1和c-Myc蛋白水平的变化。q RT-PCR技术检测整合素β5被上调或下调后,β-catenin下游基因Cyclin D1和c-Myc m RNA水平的变化。慢病毒转染技术构建在整合素β5稳定下调的细胞系中稳定上调β-catenin。Western blot验证β-catenin上调效率。克隆形成实验、Transwell实验、裸鼠皮下成瘤实验分别用来探究在整合素β5稳定下调的细胞系中再稳定上调β-catenin对肝癌细胞的增殖、迁移及体内成瘤的影响。生物信息学技术、双荧光素酶报告基因筛选调节整合素β5的miRNA,并用Western blot技术验证调节整合素β5效率。分别使用miR-185模拟物和抑制剂处理细胞系,q RT-PCR验证处理后miR-185变化、Western blot技术检测处理后整合素β5变化。双荧光素酶报告基因实验验证miR-185与整合素β5的3′UTR的结合位点。miR-185模拟物处理细胞系后,Western blot技术检测β-catenin的变化,双荧光素酶报告基因实验(TOP-flash/FOP-flash)实验检测β-catenin/TCL/LEF的转录活性。miR-185抑制剂处理整合素β5稳定下调的细胞系后,Western blot技术检测β-catenin的变化,双荧光素酶报告基因实验(TOP-flash/FOP-flash)实验检测β-catenin/TCL/LEF的转录活性。miR-185抑制剂分别处理整合素β5稳定下调或β-catenin稳定下调的细胞系,克隆形成探究对增殖能力的影响、Transwell实验探究对迁移能力的影响。q RT-PCR检测肝细胞癌与癌旁组织中miR-185的含量,免疫组化检测肝细胞癌和癌旁组织中整合素β5、β-catenin的表达情况并做相关性分析。结果:1.Huh-7和MHCC-97L稳定下调整合素β5的细胞系的克隆数量及迁移数量显著低于对照组,相反,在Huh-7稳定上调整合素β5的细胞系的克隆数量及迁移数量显著高于对照组。2.MHCC-97L稳定下调整合素β5的细胞系的皮下成瘤的大小及重量显著小于对照组。3.β-catenin与整合素β5存在相互作用关系。4.在Huh-7和MHCC-97L稳转细胞系中,β-catenin蛋白表达在整合素β5下调细胞系中明显要低于对照组。在MHCC-97L稳定上调整合素β5的细胞系中,β-catenin蛋白表达在整合素β5上调细胞系中明显要高于对照组。然而无论是在整合素β5上调还是下调的细胞系中,β-catenin的m RNA水平均无显著差异。5.在Huh-7和MHCC-97L稳定下调整合素β5的细胞系中经过MG132处理后可以有效地补偿β-catenin的蛋白表达,经过放线菌酮的处理后,稳定下调整合素β5细胞系中的β-catenin降解速度明显要快于对照组,稳定上调整合素β5细胞系中的β-catenin降解速度明显要慢于对照组。6.在整合素β5稳定下调的细胞系中β-catenin的泛素化信号比对照组明显增强,在整合素β5稳定上调的细胞系中β-catenin的泛素化信号比对照组明显减弱。7.在整合素β5稳定上调的细胞系中β-catenin/TCL/LEF转录活性显著高于对照组,在整合素β5稳定下调的细胞系中转录活性显著低于对照组。8.在整合素β5稳定上调的细胞系中Cyclin D1和c-Myc的蛋白水平和m RNA水平均明显提高,在整合素β5稳定下调的细胞系中Cyclin D1和c-Myc的蛋白水平和m RNA水平均明显降低。9.在整合素β5稳定下调和对照组中予以β-catenin稳定上调后,克隆数量及迁移数量均增加且克隆总数和迁移总数无统计学差异。在裸鼠成瘤实验中,整合素β5稳定下调和对照组中予以β-catenin稳定上调后,成瘤的大小和重量均显著增加。10.miR-271和miR-185均能抑制整合素β5的表达,且miR-185抑制效果最明显。11.双荧光素酶实验报告检测结果显示miR-185与(0-500)片段载体共转染后荧光素酶活性抑制最显著。12.当MHCC-97L和Huh-7用miR-185模拟物处理后,同时出现整合素β5、β-catenin蛋白水平的下降以及β-catenin转录活性的降低。13.用miR-185抑制剂处理MHCC-97L和Huh-7,两个细胞系中整合素β5、β-catenin蛋白水平均增高,β-catenin转录活性也增强。然而,当整合素β5被沉默之后,miR-185抑制剂失去了增高β-catenin蛋白水平的能力。14.miR-185抑制剂能够增加克隆形成的数量,然而,当整合素β5和β-catenin被下调的时候,miR-185抑制剂的作用被消除。15.miR-185抑制剂能够增迁移细胞的数量,然而,当整合素β5和β-catenin被下调的时候,miR-185抑制剂的作用被消除。16.肝细胞癌中的miR-185含量明显低于癌旁。免疫组化进行分析结果显示整合素β5和β-catenin在癌组织中表达量高。结论:1.整合素β5通过调控β-catenin的稳定性促进肝癌细胞的增殖和迁移。2.整合素β5是通过影响β-catenin的泛素化来调节其稳定性,增加β-catenin/TCL/LEF的转录活性。3.miR-185与整合素β5的3′UTR区域中的(0-500)序列靶向结合负性调控整合素β5的表达。4.miR-185通过整合素β5依赖方式调控β-catenin的表达,影响肝癌细胞的增殖和迁移。5.miR-185在肝细胞癌中低表达。


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