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三氧化二砷对人胃癌细胞端粒酶活性的影响及端粒酶在人胃癌基因治疗中的应用

尹家俊  
【摘要】: 中国传统医药学在防治肿瘤的历史长河中积累了丰富的经验,其理法方药和各种治则的运用有许多独到之处,这是中西医结合防治肿瘤的主要基础。积极和充分地汲取现代科学技术,包括现代医学的一切先进成果,开展肿瘤扶正培本、活血化淤、清热解毒、化痰去湿、以毒攻毒、疏肝理气等治则与免疫调节、微循环、细胞生物学、分子生物学、生化学、基因工程学等新技术的深入探讨,将对癌症起因机理,防治方法提供可论证数据,以阐明控制癌症发生发展、防止复发转移等方面的理论。以毒攻毒的治则见于我国科学家率先采用砒霜(三氧化二砷)疗法,在治疗急性早幼粒细胞白血病中已从细胞和分子生物学的角度阐明了作用机理,其制剂亚砷酸注射液被批准为我国二类新药,为美国食品与药品管理局(FDA)正式批准应用。砒霜疗法用于晚期肝癌、淋巴系统肿瘤可能有效,为其它消化道肿瘤、实体癌的治疗带来曙光。 胃癌在我国各种恶性肿瘤中占首位,每年死于胃癌的患者约16万。因此,针对胃癌治疗的研究成为临床和基础研究工作的重点,特别是随着人类基因组计划的完成,基因治疗将成为二十一世纪肿瘤治疗的重点策略。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶,它能以自身的RNA作为模板合成端粒,弥补端粒丢失,对维持端粒长度,使细胞获得永生化起重要作用。端粒酶是迄今发现的一个最为广谱和特异的肿瘤标志物,与细胞衰老、永生化和肿瘤的发生、发展有密切关系。端粒酶之所以能成为肿瘤治疗的新靶点,在于大多数正常组织中没有活性或活性极低,而85%以上的恶性肿瘤具有很高的端粒酶活性。人的端粒酶复合物由多种成份组成,但是端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)却是控制端粒酶活性的关键组分。在细胞永生和肿瘤进展过程中端粒酶的激活需要诱导hTERT的表达。最近的研究报道,hTERT基因与端粒酶活性具有密切的相关性。因此,利用hTERT基因作为肿瘤治疗的靶点,将使基因治疗更具有明确的靶向性。基于此思路,我们首先研究了三氧化二砷对人胃癌细胞端粒酶活性的影响 及可能的作用机制,为三氧化二砷作为端粒酶抑制剂用于胃癌的治疗提供新的理 论依据。其次,我们探讨了端粒酶逆转录酶基因在人胃癌细胞基因治疗中的作用。 论文一 二氧化二砷对人胃癌BGC.823细胞端粒酶的影响 目的研究三氧化二砷对人胃癌BGC七23细胞端粒酶的影响及可能的作用机 制。方法以不同浓度的三氧化二砷作用于人胃癌BGC七23细胞,通过MTT法测 定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡;IRAP PCR ELISA方法检测 细胞端粒酶活性的变化;RTICR半定量方法检测细胞端粒酶hTERT基因InRNA 的转录水平。结果三氧化二砷可明显抑制人胃癌BGC七23细胞的生长,诱导细胞 发生凋亡,引起细胞的端粒酶活性明显下降,显著抑制细胞hTERT基因的转录。 结论AsZO3可明显抑制人胃癌BGC七23细胞的增殖,抑制作用随三氧化二砷浓度 的升高及作用时间的延长而增强。AsZO3可抑制BGC七23细胞的端粒酶活性, BGC七23细胞端粒酶活性的下调与AsZO3作用时间和浓度有关,呈现明显的时间一 剂量效应关系。三氧化二砷对人胃癌BGC七23细胞的抑制作用可能是通过二条途 径实现:一是诱导细胞凋亡,另一个是通过下调hTER基因InRNA的转录来下调 细胞的端粒酶活性。 论文二 端粒酶反义hTERT基因逆转录病毒载体的构建 目的构建反义人端粒酶逆转录酶(1fir.nx)基因真核表达载体。方法一步 法从人慢性髓原白血病细胞株K562细胞中提取总RNA,通过逆转录多聚酶链式 反应(RT-PCR)扩增出人端粒酶逆转录酶基因起始密码子至下游长 156个碱基的 DNA片断,反向连人逆转录病毒载体pLNCX的限制性内切酶Hnd Ill和 Cel 酶切位点上,即构建成htw的反义表达载体,并经酶切鉴定和测序确认。结果 测序证明,构建的表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 pLNCX的多克隆位点上。所构建的反义hTERT基因真核表达载体与设计完全一 致。结论成功构建了人端粒酶hTER基因反义表达载体,为进一步研究反义 hTERT基因转染对胃癌细胞端粒酶及生物学行为的影响奠定了基础。 论文三 端粒酶反义hTER基因转染对人胃癌细胞系的影响 目的将构建成功的人端粒酶反义hTW基因逆转录病毒载体转染人未分化 胃癌细胞系HGC.27,并观察其对人胃癌细胞生物学特性的影响,探讨反义hTERT 基因治疗的可行性。方法通过RT-PCR扩增出人端粒酶hTERT基因起始密码子下 游长156hp的cDNA片段,将其反向插入到逆转录病毒载体pLNCX上,构建hTERT 基因的反义表达载体,并经酶切鉴定和测序确认。将反义表达载体经脂质体介导 转染人未分化胃癌细胞系 HGC.27,通过 Southern blot检测外源反义基因的整合; RTPCR及DNA测序法检测反义基因的转录:RTICR半定量方法检测被封闭目 的基因 InRNA的转录水平;IKM PCR ELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式 2 细胞促检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合到细胞基因组之


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