肝纤维化形成中MMP-1、TIMP-1表达及益气软肝方保护作用的实验研究

【摘要】： 肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝损伤向肝硬化进展的关键阶段。细胞外基质(ECM)合成与降解失衡、基质重构、间质型胶原成分Ⅰ、Ⅲ型胶原等异常增多而沉积是肝纤维化的病理基础。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类具有Zn~(2+)依赖性的内源性蛋白酶，可降解多种ECM成分，其特异性抑制剂-金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)可对该酶系活性产生抑制作用。慢性肝损伤时，主要参与降解Ⅰ、Ⅲ型胶原的是MMP-1，如果MMP-1及抑制因子TIMP-1比例失调，会导致Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少而沉积导致肝纤维化。对MMP-1、TIMP-1的动态研究有助于显示它们的作用。中药为抗肝纤维化的手段之一。益气软肝方(PGSL)为大连市中医医院的经验方剂。近40年来，共治疗3000余例慢性肝病患者，临床研究发现有一定抗肝纤维化、预防肝硬化的作用。我国慢性肝病的主要原因是乙肝病毒感染，目前还不能用乙肝病毒制备肝纤维化动物模型，有学者认为人血清白蛋白(HSA)所引起的大鼠免疫性肝纤维化模型在形态特征及发生机理上与乙肝病毒导致的肝纤维化相似。 本论文在上述研究基础上，应用HSA所致的大鼠免疫性肝纤维化模型，在肝纤维化形成的不同时期同步测定肝组织MMP-1、TIMP-1蛋白和基因水平的表达，旨在进一步了解MMP-1、TIMP-1在肝纤维化发生发展中的作用；观察PGSL对肝纤维化的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨，尤其是其抗肝纤维化作用是否与MMP-1、TIMP-1的变化有关。 一．实验性免疫性肝纤维化形成中MMP-1、TIMP-1的表达及动态研究 动物模型制备按Blackwell方法稍加改进，予HSA致敏大鼠后再予尾静脉攻击注射。在攻击注射0、2、4、6、8周后取肝。应用肝组织羟脯氨酸(HYP)的测定和HE染色监测肝纤维组织增生情况，ELISA方法测定MMP-1、TIMP-1的蛋白表达，半定量RT-PCR方法测定MMP-1，TIMP-1基因表达。结果如下：1．HYP随着HSA的不断注射逐渐升高，HE染色可见纤维组织增生逐渐加重，显示HSA所致的免疫性肝 纤维化逐步形成，提示是一很好观察肝纤维化发生、发展过程的模型。2.MMP一1在 正常肝组织有蛋白表达，在肝纤维化发生、发展过程中以及肝硬化阶段，其蛋白 表达没有显著性变化(P均0 .05);而在此过程中TI柳一1蛋白表达水平逐渐增加(自 4周始，与0周比较有统计学差别:p均0 .01)，到肝硬化阶段达到高峰(8周时， 其升高接近O周的4倍)。3.在肝纤维化形成的进展中，MMP一lmRNA表达无明显变化 (p均0.05)，而同步检测的TIMP一lmRNA表达随着时间的推移而逐渐增高(4周后分 别与O周比较，p0 .01)。4.在肝纤维化发生发展中，MMI〕一1/TIMP一1蛋白表达比值 逐渐降低，尤其是4周以后，分别与0周比较有显著差异(p0.01)。5.重新按肝 纤维化增生程度分组，随着肝纤维化程度的加重:TIMP一1的表达逐渐升 高，MMI)一1/TIMP一1比值逐渐减小。 二.PGsL对大鼠免疫性肝纤维化的保护和治疗作用 PGSL由黄茂509、白术209、丹参259、川芍1 09、桃仁159、鳖甲309、生牡 蜗509、炙甘草1鲍组成。按人鼠用药比例换算配制。动物模型为HSA所致大鼠免 疫性肝纤维化模型，PGSL保护组与攻击阶段同时灌胃，治疗组在攻击阶段第5周开 始灌胃，Zml/只/次，每日两次。在攻击注射8周末取血取肝。生化全自动测定仪 测定血清转氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)及球蛋白(Glb);放免法测定血清透明质 酸(队)及层粘连蛋白(LN)，郑少雄方法测定肝组织轻脯氨酸(HYP);EL工SA方 法测定血清转移生长因子一p，(TGF一p，)的表达;HE染色观察肝纤维组织增生与分 布情况，观察成纤维细胞增生程度，并观察肝细胞及炎细胞的变化;VG染色观察I 型胶原增生程度;嗜银染色观察工H型胶原增生程度;免疫组化方法检测Q一平滑 肌肌动蛋白(Q一SMA)在肝组织中的表达;通过透射电镜观察汇管区、纤维间隔以 外肝细胞间的窦周梭形细胞，并通过扫描电镜观察肝细胞的变化。结果如下: 1.PGSL可以降低免疫性大鼠的死亡率，保护组的死亡数更低于治疗组。2.PGSL可 以保护肝细胞一降低血清转氨酶，光镜及电镜下显示减轻的肝细胞损伤。3.PGSL 可以降低纤维组织增生程度一降低血清HA、LN和肝组织HYP含量(P均0 .01)，降 低大鼠肝脏成纤维细胞、I型及IH型胶原增生程度。4.PGSL可以降低血清TGF- pL浓度。5.免疫组化染色可见Q一SMA在一些梭形细胞中的表达，透射电镜证实这 些细胞大多数是激活状态的星状细胞(HSC)，PGSL可以减少激活状态的HSC的数目 (p均(0.既)。7.PCSL可以抑制炎细胞浸润。8.上述结果中除死亡率外，保护组较 治疗组无统计学差别，但显示出更有效的趋势。 三.pGSL对肝纤维化大鼠肝组织MMp一1、TIMP一1表达的影响 动物模型为HSA所致大鼠免疫性肝纤维化模型，PGSL与攻击阶段同时灌胃， Zml/只/次，每日两次。在攻击注射O、2、4、6、8周后取肝。应用肝组织轻脯氨 酸(盯P)测定和HE染色监测肝脏纤维组织增生情况，ELISA方法测定MMP一l、TIMP一1 的蛋白表达，半定量RT一PCR方法测定8周时MMP一1，TIMP一1基因表达。结果如下: 1.附p测定、大体标本及HE染色提示肝纤维化逐渐形成的过程及PGSL可以延缓肝 ?