降钙素基因相关肽在肾性高血压大鼠心房肌电重构中的作用

【摘要】： 背景和目的 降钙素基因相关肽(CGRP)是迄今为止发现的作用最强的内源性扩血管物质，CGRP及其受体广泛分布于神经系统和心血管系统，对心血管系统的功能有很强的调节作用，在高血压、冠心病、心力衰竭等疾病中，CGRP的减少和代偿性升高均参与疾病的发展。人群中高血压病病人逐年增多，高血压病人常常并发各种房性心律失常，如心房颤动(房颤)等，而且已经证明房颤模型和病人有明显心房肌的电重构，心律失常的发生与心房肌的电重构和L型钙通道、瞬时外向钾通道和Na~+通道的改变密切相关。因此，我们推测高血压模型心房肌的离子通道会有特定的改变，并最终导致房性心率失常的发生，而且这种改变可能与心房肌内CGRP水平的变化有关。临床上研究高血压病人的心房肌离子通道的改变很难实现，以往对高血压模型心室肌电重构的研究较多，而心房肌的电重构未见报道。故本研究应用Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用经典“2肾1夹”型Goldblatt高血压模型，详细观察了在肾性高血压形成过程中，大鼠血浆、脊髓、心房肌内CGRP免疫阳性物质(iCGRP)的动态变化，心房肌内与电重构相关的部分离子通道mRNA的变化，包括Na~+通道α亚单位(Na~+-α)、L型钙通道α_(1C)亚单位(CaL～α_(1C))、钠钙交换器(NCX)、瞬时外向钾通道α亚单位(Kv4.3)，分析其变化的意义；利用全细胞膜片钳技术，观察CGRP对正常SD大鼠心房肌I_(Na)、I_(Ca，L)和I_(to)电流的影响，在细胞水平，为探讨CGRP对心房肌离子通道重构的影响提供直接证据。同时还观察了钙拮抗剂-地尔硫卓对心房肌内iCGRP、CaL-α_(1C)和NCX mRNA的影响，以探讨钙拮抗剂对心肌细胞钙的内稳态的保护机制。 方法 大连医科大学动物中心提供雄性SD大鼠，6～7周龄，体重150～180g，自然昼夜，自由饮水摄食。经典“2肾1夹”肾性高血压模型：用内径0.22mm～0.25mm的U型银夹夹住左肾动脉近心端，右肾保留；假手术组只分离左肾动脉，不夹银 夹。术后每周2次套尾法监测尾动脉血压。 肾动脉狭窄和假手术大鼠于术后第1周、2周、4周、6周，后眼眶静脉丛采 血lml，分离血浆，一70℃冰箱保存，放射免疫法测定各组动物血浆iCGR卫含量。 肾动脉狭窄大鼠分别于手术后2周、4周、6周断头处死，假手术和正常大鼠为对 照(每组6只)，取脊髓上段、左右心耳，洗净，吸干，一70℃冰箱保存。提取组织 蛋白和总RNA后，Westemblot比较各组动物脊髓和心房肌内记GRP含量;RT一PCR 半定量法比较各组动物，脊髓和左右心耳内CGR卫mRNA的含量，以及左右心耳内 Na+一。、CaL一。Ic、NcX、Kv4.3 mRNA的含量。利用全细胞膜片钳技术，观察比较 两种浓度CGRP(0.05。M和。.12 oM)在体外对正常SD大鼠心房肌三种离子通道 爪a、Ica，L和It。电流密度的作用。 另外，将肾动脉狭窄大鼠分3组:高剂量组(HD组)、低剂量组(LD组)和 对照组(C组)，手术后1周开始灌胃治疗，2次/天，1一1.5 mF次，HD组和LD 组分别给钙拮抗剂一地尔硫卓250m叭留d和50 mg瓜g/d，对照组灌蒸馏水。治疗后 4周后与假手术组(S组，灌蒸馏水)同时断头处死(每组6只)，Westerrlblot法 比较各组动物脊髓和心耳内iCGR卫含量的变化，RT一PCR半定量法比较心耳 CaL一a、e和NCx 1llRN^含量的变化。 计量资料用均数士标准差表示，方差分析进行组间均数差异性比较，P0.05 认为有显著性差异。 结果 肾动脉狭窄大鼠于术后1周，收缩压已经明显高于术前(尸0.05)，5一6周 趋于稳定。随着血压的增高，大鼠出现心室体重指数增大，提示存在心室肥厚; 左肾重量降低、明显缩小，右肾重量增加，代偿性增大。90%的模型满意。 术后1周，肾动脉狭窄大鼠血浆iCGRP己明显低于术前和假手术组(尸0.05)， 术后2周最低，3周和4周有所回升(尸0.05 vsZ周)，但仍明显低于术前和假手 术组(尸0.05)。 Westemblot法检测大鼠脊髓内iCG即发现，随着血压的升高，肾动脉狭窄大 鼠在术后第2、4、6周，iCGR卫条带密度明显高于假手术组和正常大鼠(尸O乃1)。 RT一PCR半定量法比较大鼠脊髓CGRP zllRNA含量发现，在术后第2、4、6周肾 动脉狭窄大鼠明显高于假手术组(P0.OI)。随着血压的升高，脊髓内CGRP mRNA 含量也逐渐增加。 Westemblot法检测正常大鼠右心耳iCG即条带平均密度明显高于左心耳，提 示大鼠右心耳iCGRP多于左心耳。肾动脉狭窄大鼠左右心耳的iCGRP的条带平均 密度，在第4和第6周明显高于第2周、正常大鼠和假手术大鼠(左心耳在第2 周己经开始增高)，提示血压升高后左右心耳iCGRP明显增多。RT一PCR在大鼠心 耳内未扩增出CGRP mRNA。 在高血压形成过程中，肾动脉狭窄大鼠左心耳CaL一。:c的mRNA水平在2周 和4周明显增高，分别是假手术组的2.5倍和2.4倍(尸0.01)，右心耳在2周和 4周无明显变化，6周为假手术组的2.5倍(尸0.01);左心耳NCX的mRNA水 平在4周、6周分别是假手术组的1.9倍、1.4倍(尸0.01)，而右心耳NCX的mRNA 水平在2周、4周、6周都明显增高，分别是假手术组的1.4倍、1.5倍、1.4倍， (P0.02);左心耳Kv4.3的mRNA水平在4周和6周分别是假手术组