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人参皂苷Rb_1水解酶的分离纯化及其性质的研究

刘欣  
【摘要】: 人参皂苷Compound K—20(S)原人参二醇β-D呋喃葡萄糖苷(20(S)-β-D-glucopyranosyl protopanaxadiol,简称C-K)是一种非天然的人参皂苷成分,由天然二醇型人参皂苷(protopanaxadiol-type ginsenosides,简称PTG)如人参皂苷Rb_1、Rb_2、Rd等经肠道菌分解代谢转化生成。目前研究表明,它具有抗突变、抑制癌细胞转移、抗肿瘤细胞毒、诱导肿瘤细胞调亡、逆转肿瘤耐药和抗肿瘤诱导的血管新生等多种药效活性,在韩国已进入Ⅲ期临床研究。因此,C-K的大量制取和生产方法成为产业化的关键而备受关注。 目前通用制取低极性人参皂苷的方法有酸水解、碱水解、Smith降解和热解等化学方法,因化学水解法首先去除人参皂苷C_(20)位的糖基,因而C-K只有通过生物转化的方法制备获取。在生物转化方法中,酶法降解由于其具有条件温和、步骤简单、选择性高、副产物少的优点,已成为制备人参皂苷C-K的首选。中国科学院大连化学物理研究所1806组通过实验研究,已从多种不同来源的水解酶中筛选出一种软体动物来源、可高效降解人参皂苷Rb_1的混合酶,命名为SE酶。本实验选定SE酶作为分离纯化的对象,通过筛选、分离和纯化Rb_1水解酶,为研究糖苷酶水解功能和性质奠定基础。 本论文从糖苷酶的检测手段入手,以原酶为对象对比了定性和定量的糖苷酶活性检测手段,在定量方法中比较了以人工底物pNPG等和天然底物人参皂苷Rb_1为酶解对象的作用条件,结果显示:1、定性方法主要采用聚丙酰胺凝胶电泳,SE原酶上样量在7~10μg左右为适;2、在进行糖苷酶分离纯化过程中,人工底物pNPG水解产生的p-Nitrophenol、人参皂苷Rb_1水解生成的Rd可分别作为酶活性的检测和监测的对象;3、以pNPG为底物时,其产物p-Nitrophenol检测范围是0.0067~0.04mM,水解时间30min,水解温度为37℃;最适pH值为5.2;4、以Rb_1为底物时,其产物Rd检测范围是55.75μg/ml~1.784mg/ml;水解时间6min,反应温度40℃,pH为4.5。 为了确定纯化的条件,本实验比较了数种分离纯化的方法:1、硫酸钱盐析与 乙醇沉淀法处理量大,但分离纯化效果不佳:2、DEAE一Sepharose离子交换层析、 HA层析和凝胶过滤层析对SE酶均有较好的分离效果。3、DEAE离子交换层析和SE 酶糖昔酶荧光活性染色结果显示,SE酶中至少含有7种以上糖普酶的同功酶:HA 层析结果显示目标酶是中性或酸性蛋白质。 在上述工作的基础上,我们设计出一套合理而可行的实验方案,通过 DEAE一Se户harose离子交换分段层析,DEAE一Sepharose离子交换梯度层析和 SephadexG一100凝胶过滤层析三种方法的联用将SE酶中能够水解人参皂昔Rb;的 水解酶分离和纯化至SDS一PAGE上呈单一蛋白质条带,并通过活性染色证实。应用 SDS一PAGE和凝胶过滤层析对分子量的测定,提示该酶是由4个分子量为1 10一1 1 SKD 的相同亚基组成。 最终,我们对纯化的目标酶进行基本酶学性质的分析:1)目标酶的最适pH 值为5.6,最适温度是80℃。pH稳定范围很广,在pH4.0的溶液中和温度60℃ 以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖昔酶.2)目标酶对Na+、 K+、Li+、eaZ+、MgZ+、ED认、DTT和sns的敏感,但对euZ+、^g+和Fe,+敏感, 经DTT保护实验证明,该酶结构中具有维持酶活性的琉基。3、以Lineweare一Burk 双倒数做图法切NTG为底物的动力学参数Kln和Vmax分别为0.182 mM和0.189 林mol/mi川mg;以Rbl为底物的动力学参数Km和vmax分别为0.790 mM和10.192 林m。腼i可mg。4、在本实验条件下,Rbl的酶经时作用中只监测到产物Rd的存在, 该结果的意义还需要进一步验证。 本实验从SE中分离纯化出一种新型、高效水解人参皂昔Rb,的p一葡萄糖昔 酶,为天然人参皂昔和其它天然糖昔类化合物的生物转化产物的发现、开发和应 用提供有效的工具并奠定了基础工作。


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