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体外诱导淋巴瘤、白血病细胞株向DC分化的实验研究

方美云  
【摘要】:目的 恶性淋巴瘤、急性白血病及实体瘤的发病大多是由于机体免疫功能减弱,不能及时清除癌变细胞,致大量癌细胞在体内增殖而发病。树突状细胞(DC)是人体内的专职抗原提呈细胞,它摄取、加工、处理抗原,然后在细胞内与MHC-Ⅱ类分子结合,将MHC-Ⅱ类分子、抗原复合物提呈给初始T淋巴细胞,激发特异性免疫反应。因此树突状细胞是体内特异性免疫反应的始动者。而患恶性淋巴瘤、急性白血病时体内DC功能是减弱甚至缺陷的。因此提高这类患者的DC功能,对提高患者的特异性抗肿瘤免疫无疑是关键的。目前针对肿瘤通过DC的治疗研究有如下方法:1)取自体外周血单核细胞体外诱导并扩增DC,然后用肿瘤抗原冲击,体内回输;2)用白血病细胞体外诱导扩增DC,体内回输;这样的DC携带大量肿瘤细胞的抗原信息,无疑可增强特异性抗肿瘤效应。3)将具有免疫调节作用的细胞因子基因和抗肿瘤作用的基因转染入树突状细胞,从而提高树突状细胞的功能。如将IL-2基因、P53基因导入DC,上述基因表达增强了DC的功能。上述研究的深入开展展示了树突状细胞广阔的应用前景。根据树突状细胞来源,可以将其分为两大类:髓系树突状细胞和淋巴系树突状细胞。在体外研究者们已成功地将髓系和淋巴系白血病细胞诱导分化成功能成熟的树突状细胞,这意味着淋巴系来源的肿瘤细胞在一定条件下有诱导成为树突状细胞的可能。如果在体外能利用自身肿瘤细胞成功诱导大量DC,这种DC无MHC限制,并提供大量肿瘤细胞自身的抗原信息,作为特异性免疫治疗的一种方法,将会调动肿瘤患者的主动免疫功能,这对治疗肿瘤患者将提供新方法、新思路,改变肿瘤的治疗效果。 方法 我们选择了T、B两大类3株淋巴瘤细胞:Daudi B细胞来源、Ramos B细胞来源、Jurkat E6-1 T细胞来源,及两株白血病细胞,K562及 WP=5 HL-60,采用下述细胞因子:GM-CSF、IL-4、INF、TNF联合具有诱导分化作用的人参皂甙和三氧化二砷,与肿瘤细胞分组进行培养,研究DC的诱生情况。细胞因子组合分组为:1)GM-CSF、IL-4;2)GM-CSF、IL-4、INF;3)GM-CSF、IL-4、TNF,在上述各组中再分别加入不同浓度的人参皂甙和三氧化二砷,并同时设单独应用人参皂甙、三氧化二砷组,分别与5株肿瘤细胞共同培养。细胞因子的浓度分别为:GM-CSF:100ng/ml,IL-4:10 ng/ml,INF-γ:10 ng/ml,TNF-α:10 ng/ml,Rg1组:1.0μg/ml,Rg2组:0.5μg/ml,As2O31组:0.5μmol/ml,As2O32组:0.8μmol/ml。在培养的7天、10天或7天、14天时用光学显微镜和电子显微镜(扫描及透射电镜)观察并记录诱导DC的形态学变化。同时分别检测DC相关抗原:CD86、CD1a、HLA-DR、HLA-ABC、CD11c的表达情况,用ELISA方法检测培养上清液中的IL-12和INF-γ的分泌量。培养诱导10或14天后,再与原代细胞以1:10的比例继续培养24小时,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。诱导后的DC,选取Jurkat及K562细胞采用MTT法检测混合淋巴细胞反应(MLR)。 结果 在体外,无论是淋巴瘤细胞株抑或是髓系来源的白血病细胞株都可诱导出不同比例的树突状细胞。淋巴瘤细胞株的DC相关抗原表达率约50%左右,白血病细胞株约30%左右。通过光学显微镜和电子显微镜的形态学观察,可出现典型的树突状细胞的形态学改变。这些细胞表达DC特异性抗原CD1a、CD11c,表达共刺激分子CD86。在淋巴瘤细胞株MHCⅠ、Ⅱ类分子表达显著上调,在白血病细胞株MHCⅠ、Ⅱ类分子由诱导前阴性至诱导后阳性。从特异性抗原表达比例分析DC诱导产率,淋巴瘤细胞株高于白血病细胞株。在3株淋巴瘤细胞中以Jurkat为佳,K562与HL60相比较,则K562优于HL-60细胞。在上述5株细胞中,细胞因子联合人参皂甙及三氧化二砷,DC产率有增加,表现为DC相关表面标志表达增高,其作用与二药浓度有关。人参皂甙以1.0μg/ml,As2O3以0.5μmol/ml为宜。单独应用人参皂甙或三氧化二砷与5株细胞共培养后,均有程度不同的DC相关抗原表达,但明显低于联合应用细胞因子组。在Ramos、Daudi及Jurkat淋巴瘤细胞以IL-4、GM-CSF、TNF联合人参皂甙(1.0μg/ml)组DC相关抗原表达最高。在HL-60细胞以IL-4、GM-CSF联合三氧化二砷(0.5μmol/ml)DC相关抗原表达高于其它组合,同时我们用GM-CSF、IL-4 WP=6 与IL-4、INF的组合进行了比较,GM-CSF、IL-4组优于IL-4、INF组。而在K562细胞组则以IL-4、GM-CSF、INF联合人参皂甙(1.0μg/ml)组为最佳。Jurkat淋巴瘤细胞以IL-4、GM-CSF、TNF联合人参皂甙(1.0μg/ml)培养10天的DC相关抗原表达率为:CD86:48.92%、CD1a:54.72%、HLA-DR:47.93%、HLA-ABC:70.57%、CD11c:47.76%;在K562细胞以IL-4、GM-CSF、INF联合人参皂甙(1.0μg/ml)培养14天的DC相关抗原表达率为:CD86:32.02%、CD1a:27.18%、HLA-DR:25.99%、HLA-ABC:27.02%、CD11c:37.74%。在各株细胞的培养上清液中,均检测到IL-12和INF-γ,上述两种细胞因子在淋巴瘤细胞株中7天时起均显著高于对照组,10天时明显高于7天。而K562和HL-60细胞则于7天时即达高峰,14天时分泌水平未见增加。诱导后的细胞继续与原代细胞培养,发现DC对肿瘤细胞有杀伤作用,可使凋亡率明显增加。进行MLR的结果为,MLR较对照组明显增高,Jurkat-DC高于K562-DC。 结论 1) 淋巴瘤细胞株Jurkat、Daudi及Ramos和白血病细胞株K562、HL60在细胞因子或分?


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