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中性粒细胞功能改变在重症急性胰腺炎肺损伤中的发病学意义及清胰汤防治作用的研究

闻庆平  
【摘要】:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的一个常见并发症,它是机体过度炎症反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏的结果。以前的多数研究中,机体单核-巨噬细胞系统活化释放各种细胞因子和炎性介质的作用一直是SAP时ALI发病机制研究的重点。目前,中性粒细胞(PMN)在SAP时ALI发病中的机制逐渐受到重视,并成为各相关学科临床及实验研究的热门课题。已有临床和实验研究发现SAP时肺组织中有大量的PMN聚集,正常情况下,PMN生存周期很短,通过凋亡方式保持动态平衡。凋亡是一种正常的细胞生理死亡方式,其区别于坏死的重要之处在于凋亡的细胞能被巨噬细胞或周围组织细胞平稳识别和清除而不引发炎症反应。但是,当PMN凋亡减少或延迟时,PMN不能被及时清除,会导致PMN呼吸爆发和细胞毒性内容物的持续释放,引起周围组织损伤。因此,如果能明确SAP时肺组织中PMN聚集的机制、PMN的凋亡变化规律以及凋亡过程中涉及的信号分子或信号转导机制,我们就可以针对各调控点来抑制PMN在肺内募集、促进炎性部位的PMN发生凋亡和限制过度呼吸爆发导致的组织过氧化损伤,从而达到防治SAP时ALI的目的。 基于对以上研究现状的认识,本研究采用胰管逆行注射1.5%去氧胆酸钠制成大鼠SAP时ALI模型。选用纯雄性健康Wistar大鼠共138只,随机分成5组:假手术对照组(SHAM,n=18);SAP模型组(SAP,n=30);SAP+乌司他丁治疗组(ULI,n=30);SAP+地塞米松治疗组(DEX,n=30);SAP+清胰汤治疗组(QYT,n=30);每组分造模后6h、12h、24h三个时间点,分离肺泡灌洗液中PMN,利用流式细胞仪、RT-PCR、免疫组化等方法检测各组肺泡灌洗液PMN功能的变化,探讨1)SAP时ALI大鼠肺泡灌洗液PMN表面的整合素CD11b/CD18与血管内皮、上皮细胞表面ICAM-1配体的表达以及血清中s ICAM-1的表达;2)SAP时 ALI大鼠肺组织PMN凋亡的变化规律以及凋亡的信号转导机制;3)5妙时ALI 大鼠肺组织pMN呼吸爆发的变化;4)比较中药清胰汤、地塞米松和乌司他丁对 SAP时ALI大鼠肺组织PMN功能的影响,试图阐明PMN功能改变在S妙时 ALI中的发病学意义,论证清胰汤的治疗作用及可能机理,为临床SAP时ALI的 治疗提供新的方法和理论依据。实验结果如下: 一重症急性胰腺炎肺损伤模型的复制 本研究采用经胰管逆行注射1 .5%去氧胆酸钠复制大鼠S妙时ALI模型,造 模后在各时相点大鼠均出现呼吸困难、口唇发组;动脉血气分析结果显示PaOZ 明显降低、PaCO:明显升高及A一aDO:逐渐增加,提示大鼠均有明显的低氧血症 和氧利用障碍;肺组织病理显示微血管通透性升高,肺组织中有大量PMN浸 润,肺组织渗出、出血明显。以上实验结果表明用1.5%去氧胆酸钠制备的大鼠 SAP模型均并发急性肺损伤。 二.粘附分子表达在重症急性胰腺炎肺损伤大鼠PMN肺内聚集的作用 应用流式细胞仪和免疫组化法检测大鼠肺泡灌洗液中PMN表面 CDllb/CD18和肺组织ICAM一1蛋白的表达。结果显示:S妙组肺泡灌洗液中 PMN表面整合素CDI lb/CD18表达在各时间点均较SHAM组明显增强,6h表达 明显已明显增强,并持续到24h:SAP组大鼠肺组织ICAM一1蛋白表达强度在各 时间点均较SHAM组明显增强,组内动态观察发现随造模时间延长ICAM一1蛋白 表达增强,24h时表达最强:SAP组大鼠血清中slcAM一1浓度各时间点均较 SHAM组明显升高,24h时血清中sICAM一1浓度达到高峰,并且其变化规律与大 鼠肺损伤程度明显相关,提示血清中sICAM一1水平可以做为判断S妙病情严重 程度的一个指标及PMN活化粘附的标志。 三.重症急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织PMN凋亡及凋亡的信号转导机制 应用流式细胞仪检测肺泡灌洗液中PMN凋亡,结果显示造模后各时间点 SAP组肺灌洗液中PMN凋亡比例均比SHAM组降低:SAP组肺灌洗液中PMN 存活比例均明显高于SHAM组,表明PMN游出血管到达肺组织后PMN凋亡延 迟,存活时间延长。PMN的这种变化与SAP时ALI的发生可能有密切关系,因 为游出的PMN处于激活状态,持续释放炎性介质和毒性内容物,造成周围组织 损伤。由此我们推测,通过诱导凋亡来清除这些PMN也许可以避免继发性肺组 织损伤,从而保护器官功能。 应用免疫组化法检测肺泡灌洗液PMN中NF一KB,结果显示:SAP组术后6h 胞浆NF一xB表达开始增加,术后12h表达最明显;造模后6h,12hs”组肺泡灌 洗液中PMN胞浆[C扩+1i的浓度比sHAM组明显增加,术后24h基本恢复到正 常。RT一PCR检测肺泡灌洗液中PMN Fas邝asl mRNA表达,结果SAP组肺泡灌洗 液中PMN表面Fas用asl mRNA几乎检测不到。以上结果提示:细胞增殖和分化 过程中的一些基因、信使分子是细胞凋亡过程中的调节因子,细胞凋亡与增殖、 、分化的信号途径有着某些共同的信号分子,细胞接受相同或不同的刺激后,不同 的调节途径就会导致细胞的不同走向(增殖或凋亡),PMN内[C扩+]i升高、NF- KB表达增加和Fas下asl mRNA表达减少均可抑制肺组织中PMN凋亡,造成 PMN凋亡的延迟。 四.重症急性胰腺炎肺损伤大鼠肺组织PMN呼吸爆发的变化 SAP组与SHAM组比较,SAP组大鼠肺泡灌洗液中PMN呼吸爆发在6h、 12h增强


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