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银杏叶提取物EGb761及米诺环素对实验性自身免疫性脑脊髓炎及多发性硬化的防治研究

梁战华  
【摘要】:背景和目的 多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种慢性炎性中枢神经系统脱髓鞘性疾病,临床主要表现为复发缓解的过程及进行性加重的神经功能障碍。在我国MS已成为中青年人致残的主要原因之一。 MS病灶的病理特征为少突胶质和髓鞘的脱失,并伴有静脉周围的炎性单核细胞浸润。虽然造成中枢神经系统髓鞘结构破坏的起始原因尚不明确,但在MS病灶中发现了炎性细胞浸润提示免疫应答异常参与了中枢神经系统的炎性反应。对髓鞘抗原的细胞和体液免疫反应的发现、MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)在病理学和临床方面的相似性、MS和人类白细胞抗原单倍型的基因相关性以及临床应用免疫抑制剂与免疫调节剂治疗有效,均支持MS为一种病因与自身免疫相关的疾病。 目前,对MS的治疗主要是针对该病的免疫学成份。在国内,常用于MS的治疗药物有皮质类固醇、干扰素β、环孢素A等。 近年来,对MS的治疗有了新的进展,美国食品药物管理局(FDA)已批准用于MS治疗的免疫调节剂及免疫抑制剂有:干扰素β(IFNβ)、glatiramer乙酸盐(GA)米托蒽醌(Novantrone),但这些药物的疗效不十分满意而且价格昂贵,以及其潜在的副作用及毒性,迫使我们探索新的方法来限制中枢神经系统的炎症和脱髓鞘。 标准化银杏叶提取物EGb761为一种从银杏树干燥后的绿叶中纯化出的天然产物,在临床上已经被应用广泛用于治疗阿尔茨采默(Alzheimer)痴呆、血管闭塞和耳蜗前庭疾患。这种制剂由复杂的混合成分组成(即24%黄酮甙和4~6%的萜类生物碱),分子量相对较小使其可以通过血脑屏障的阻隔,在中枢神经系统中发挥药理学活性。 WP=6 已知EGb761可以改善脑内注射链脲霉素后大鼠的神经元能量代谢损害;拮抗谷氨酸盐诱导的神经毒性作用;保护Na+、K+-ATP酶的活性,从而抵抗脑缺血保护脑组织。制剂中的萜类生物成分有调节脑缺血后血流动力学的作用,并能够抑制血小板活性因子诱导的血小板聚集;另外,已知黄酮类化合物成分具有抗氧化和自由基清除剂的作用,能够抑制脑缺血后一氧化氮合成酶的活性,故被广泛用于缺血性脑血管病的症状治疗及康复期治疗。 二甲胺四环素(minocycline米诺环素)是四环素类第二代抗炎药,有亲多组织的生物学效应,不管血脑屏障(BBB)是否有炎症,它弥散入中枢神经系统良好,除了已知的抗微生物的作用外,国外最新研究发现米诺环素显示了多种抗炎作用,包括抑制基质金属蛋白酶(MMPS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生,还可抑制小神经胶质细胞的活性和繁殖。而这些因素都包含于多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎的病理生理中,因此作为已证实的抗炎药物还具有神经保护作用,有可能作为复发-缓解型多发性硬化的治疗药物。 本项研究分基础和临床两部分 基础研究: 实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是最有价值的自身免疫模型之一,用于探讨生理性和病理性免疫反应过程的诸多机制,也是多发性硬化的经典动物模型。 本实验以英国短毛种豚鼠为研究对象,采用新鲜豚鼠脊髓匀浆与完全福氏佐剂制备成的抗原乳剂,给动物行足底皮内注射,制造EAE动物模型。实验动物随机分为五组:正常组、模型组、泼尼松治疗组、EGb761治疗组、米诺环素治疗组。正常组给完全福氏佐剂和生理盐水,模型组给抗原乳剂和生理盐水,其余三组在给抗原乳剂后当日开始分别用灌胃法给泼尼松0.14mg/100g/日,EGb761 1.67mg/100g/日,米诺环素1.10mg/100g/日。各组动物均在造模0、18、34天乙醚麻醉,内眦采血,留取血清,-80℃保存。每日观察并记录动物发病状况。全部动物在免疫后五周处死,经心脏灌流,取脑和脊髓,多聚甲醛固定,病理切片,光镜下HE及LOYER染色观察;应用双抗夹心ELISA法检测血清中IL-12含量;应用放免法(RIA)测血清中IL-10、神经肽Y(NPY)和β-内啡肽(β-EP)含量;采用SABC免疫组化法检测脑组织转化生长因子β(TGF-β)、基质金属蛋白2(MMP-2),一氧化氮合酶(NOS)表达情况,每张切片随机选取5个高倍视野,每个视野记数100个细胞,观察胞浆呈棕黄色的阳性细胞,记数阳性细胞百分数。 计量资料以均数±标准差表示,用SPSS10.0软件包进行单因素方差分析及多元相关分析,以P0.05为显著性检验界限。 WP=7 结果: 1.病理学结果:与正常组相比,光镜下HE和LOYER染色观察发现模型组动物脑组织出现大量炎性浸润,以淋巴细胞为主,形成血管套;神经元有变性坏死现象;脑脊髓白质均见明显的髓鞘脱失,呈海绵状改变;可见胶质细胞增生,有的形成胶质结节。90%的模型满意。 2.EAE发病情况:与模型组相比,泼尼松和EGb761治疗组延缓了动物发病,且EAE临床评分明显减少(P0.05),米诺环素治疗组与模型组相比无统计学差异。 3.血清学改变:与正常组相比,发病豚鼠的血清IL-10均明显增高(P0.05),其中泼尼松和EGb761治疗组IL-10水平明显高于模型组和米诺环素组(P0.05);IL-12水平第0天明显低于第18、34天(P0.05),其中第18天IL-12水平最高; 4.神经递质变化:EAE的三个治疗组NPY浓度均低于EAE模型组,有统计学差异(P0.05);而三个治疗组β-EP含量明显高于EAE模型组,有统计学差异(P0.05)。 5.免疫组化结果:泼尼松和EGb761组TGF-β明显高于其余三组(P0.05);而MMP-2?


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