小胶质细胞和星形胶质细胞在多巴胺能神经元变性和保护中的可塑性变化

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是中枢神经系统的老年变性疾病， 主要症状包括静止性震颤、肌肉强直、运动减少。病理特征为中脑黑质致密带多 巴胺(Dopamine，DA)能神经元渐进性变性脱失，纹状体区DA减少，残存的DA能 神经元内形成以突触核蛋白(alpla-Synuclein，α-Syn)为主要成分的嗜酸性 包涵体一路易小体(Lewy bodies，LBs)。α-Syn是一种由140个氨基酸组成的蛋白 质，存在于DA能神经元突触前神经末梢。α-Syn聚集或其基因的过度表达导致 DA能神经元变性脱失。目前，主要用DA替代疗法缓解PD症状，但并不能阻止病 程进展。本研究采用野生型和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase) 基因敲除动物腹侧中脑神经-胶质细胞混合、纯神经、纯小胶质细胞、纯星形胶质 细胞、神经-星型胶质细胞混合培养及重组细胞培养体系，探讨α-Syn对小胶质细 胞持续激活和DA能神经元持续变性的作用及其机制。同时探讨了右甲吗喃 (Dextromethorphan，DM)及其类似物3-羟基吗啡喃(3-hydroxymorphinan，3-HM) 对于 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methy1-4-phenyl-1，2，3， 6-tetrahydropyridine，MPTP)和细菌内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) PD模型诱导的小胶质细胞持续激活及其产生的免疫炎性和神经毒性因子的抑制及 对DA能神经元的神经营养和保护作用的机制。 结果 一．吞噬突触核蛋白的小胶质细胞的持续激活介导DA能神经元变性 在磷酸盐缓冲液中聚集至14-21天的α-Syn经Westem Blot证明，大多数是 可溶性或不可溶性的单聚体或多聚体。在腹侧中脑神经-胶质细胞混合培养体系 中加入α-Syn10天后，特异性地导致[3H]DA摄取能力降低、DA能免疫反应阳性神 经元数目明显减少。 将星形胶质细胞加回到纯神经培养体系中，~Syn对DA能神经元具有营养作 用。随着小胶质细胞被加回到纯神经培养体系中数量的增多，a一Syn导致DA能 神经元变性明显加重;在没有小胶质细胞存在的神经一星型胶质细胞培养体系中， a一Syn对DA能神经元无损伤作用。表明小胶质细胞在~Syn导致的DA能神经元 变性中起重要作用。 在共聚焦显微镜下观察并发现，小胶质细胞吞噬荧光染料标记的a一Syn，特 异性吞噬抑制剂CytochalasinD明显抑制小胶质细胞对一Syn的吞噬作用，呈剂 量和时间依赖关系。随着小胶质细胞吞噬的q一Syn被cytochalasinD抑制，~s” 刺激小胶质细胞产生的细胞外超氧化物和细胞内活性氧类物质也被明显降低，呈 剂量依赖关系。表明小胶质细胞吞噬一Syn对其被持续激活并产生活性氧类物质 十分必要。 小胶质细胞被a一Syn激活后，出现功能和形态的可塑性变化。免疫炎性和神经 毒性因子如活性氧类物质包括细胞外超氧化物和细胞内活性氧类物质及PGEZ明显 升高。小胶质细胞从静止状态时的小圆形细胞变成增大的、不规则的、棒状和/或 阿米巴样细胞，呈剂量和时间依赖关系。 与野生型小鼠相比，一S”对NADPH氧化酶基因敲除小鼠的DA能神经元摄 取能力无明显影响，细胞外超氧化物和细胞内活性氧类物质的量无明显升高。表 明NADPH氧化酶及其介导产生的活性氧类物质是~Syn导致DA能神经元变性脱 失的重要通路。 a一Syn被小胶质细胞吞噬后，除引起其自身被持续激活外，还损伤线粒体功 能，增加细胞内活性氧类物质的产生。 二.DM通过抑制NADPH氧化酶的活性保护MPTP介导的DA能神经元变性 DM是一系列广泛使用的镇咳药的主要活性成分。本研究发现，DM对MPTP导 致的中脑黑质致密带DA能神经元变性脱失具有明显的保护作用，而NADPH氧化酶 基因敲除小鼠未见保护作用，提示DM可能通过抑制NADPH氧化酶的活性实现其保 护作用。 体外研究发现，DM明显降低小胶质细胞来源的NADPfl氧化酶产生的细胞外超 氧化物及细胞内活性氧类物质。所以，NADPH氧化酶是DM发挥保护作用的一个重 要靶点。 DM还明显降低MPTP介导小胶质细胞增生产生的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)。 DM未能减轻MPTP导致的纹状体区DA的耗竭，原因是MPTP导致纹状体区DA 的耗竭要比中脑黑质致密带DA能神经元变性脱失迅速和严重得多。而且，纹状体 区DA的补充比中脑黑质致密带DA能神经元的恢复也缓慢得多。 三.3一阴通过神经营养和抗炎作用保护LPS介导的DA能神经元变性 在腹侧中脑神经一胶质细胞混合培养体系中，高剂量(1一5叫)3一HM对DA能神 经元具有神经营养及保护作用;低剂量时，仅有神经保护而无营养作用。在纯神 经培养体系中，3一HM对以能神经元不具有直接的营养作用。将星形胶质细胞(总 细胞数的40一50%)和3一HM处理的星形胶质细胞的条件培养液加回到纯神经培养体 系中，明显增加队能神经元摄取能力。将3一HM处理星形胶质细胞6小时后提取 的RNA用于基因芯片、反转录和实时PCR技术，发现3一HM使星形胶质细胞表达转 化生长因子一困mRNA。 小胶质细胞是3一HM抗炎作用的靶细胞。将小胶质细胞加回到纯神经培养体系 后，随着加回数量的增多，LPS对DA能神经元产生的毒性就越强，3一HM的神经保 护作用就