MAP-2基因转染抑制恶性黑色素瘤细胞生长作用的研究

【摘要】：目的:以腺病毒-微管相关蛋白-2(Adenovirus-microtubule- associated protein-2,Ad-MAP-2)为载体,将MAP-2基因导入鼠恶性黑色素瘤B16C29、B16细胞系,研究MAP-2对恶性黑色素瘤(恶黑)细胞的形态学影响,以探讨MAP-2基因超表达抑制恶黑细胞生长的作用及其作用机制,为恶黑的基因治疗提供实验依据。 方法:实验分为六部分:(1)将Ad-MAP-2载体感染人胚肾(HEK293)细胞,利用空斑实验方法测定腺病毒的滴度。(2)将Ad-MAP-2载体以MOI值3.5感染B16细胞,以生理盐水作为对照,观察感染前后细胞的生长情况,计数感染前后细胞的数量变化,利用统计学软件SPSS11.5进行数据分析。(3)光镜对B16C29细胞感染前后的形态学进行连续观察。(4)应用流式细胞术(PI-ANNEXIN-V染色方法)检测MAP-2基因导入B16、B16C29细胞后的细胞凋亡情况。(5)电子显微镜观察MAP-2基因导入后细胞突起和细胞内微管的改变。 结果:(1)通过滴度测定,腺病毒的滴度达到1×1010pfu/ml。(2)Ad-MAP-2感染B16C29细胞后的第4天,细胞形态开始发生变化,从胞体延伸出长而细的树枝状突起;到第5天细胞的树突状形态更加明显。(3)Ad-MAP-2感染后的第5天,B16C29、B16细胞出现少量凋亡,利用PI-ANNEXIN-V染色方法检测Ad-MAP-2(MOI值3.5)感染 WP=5 6天的细胞,则出现明显的凋亡。(4)Ad-MAP-2感染B16细胞后的第6天,通过电镜观察到细胞内微管的含量增加,微管变长、变粗,延伸至树突,部分微管集合成束,沿着细胞的突起向前延伸。(5)通过细胞计数及统计学分析,发现Ad-MAP-2感染B16细胞后的第3天,与对照组相比,细胞数量无明显差异(t=0.336,P=0.7540.05);自感染后的第6天开始,感染MAP-2基因组的细胞数减少,其细胞数明显低于对照组(P=0.0060.01);第9天,细胞数量减少更加显著(P=0.0010.01)。 结论:(1)MAP-2在B16细胞内的超表达,可对其生长起抑制作用。(2) MAP-2基因超表达能够诱导B16C29、B16细胞的凋亡,并且该变化是其抑制恶黑细胞生长的原因之一。(3)Ad-MAP-2感染恶黑B16C29细胞后,可恢复或部分恢复恶黑细胞的树突状形态。(4)MAP-2基因在恶黑细胞B16内的超表达,可以使微管数量增加,微管延长、变粗,集合成束,沿细胞突起延伸,并且该变化是使细胞树突形状恢复的主要原因之一。本实验说明MAP-2基因的超表达能够抑制恶黑细胞的增殖,Ad-MAP-2载体有可能成为有应用价值的治疗恶黑的药物。