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参杞合剂对人高转移肺癌细胞与内皮细胞粘附及粘附分子表达的影响

王晓日  
【摘要】:目的:肿瘤是危害人类健康的第一杀手。目前治疗肿瘤的方法不外乎西医或中西医结合治疗。其中中医药在肿瘤治疗方面有其独到之处。参杞合剂(SQ)是以传统中药参杞片为基础,辅以黄芪、当归、莪术、白花蛇舌草煎制而成,据报道其在小鼠体内、外有抗瘤、抑瘤之功效。但其是否对人类肿瘤也有同样功效尚不可知。本实验通过研究参杞合剂对人高转移肺癌细胞(PG)生长调控的作用及其表面粘附分子(CD44、CD54)表达的影响,初步探讨其对人类肿瘤作用的相关机制,为今后开发抗肿瘤新药提供理论依据。 1.研究对象和方法 1.1 应用MTT法及流式细胞仪,体外研究SQ对PG细胞的抑制作用。 取体外培养的PG细胞,制成细胞悬液。调整细胞浓度为1.0×106/ml,加入96孔板中每孔100μl,然后加入不同浓度SQ100μl作为实验组,NS 100μl作为对照组,每组各设5个平行孔,置于孵箱培养,分别于12、24、48、72小时离心弃上清,加MTT应用液20μl,培养4小时后,每孔再加DMSO溶解液100μl,充分振荡,使甲臜颗粒完全溶解,酶标仪测定每孔吸光值并求出PG细胞生长抑制率。 PG细胞传代后,调整细胞浓度5×105/ml加入24孔板,1ml/孔。然 WP=5 后加入不同浓度的SQ每孔1ml,对照组每孔加入1ml的NS。每组设4个复孔,置于37℃、 5%CO2孵箱培养48小时,按文献方法经PI染色后,以流式细胞仪检测PG细胞经SQ作用后的细胞增殖周期,并计算增殖指数。 1.2 应用荧光显微镜和流式细胞仪荧光标记法,体外研究PG细胞与血管内皮细胞的粘附性、粘附分子表达以及SQ的抗肿瘤转移作用。 PG细胞传代后,根据培养液中加入SQ的浓度分为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml三组及对照组(培养液中加入等体积灭菌的生理盐水)。培养72小时后,SQ组加入CD44-FITC、CD54-FITC,对照组加入同型对照IgG-FITC,4℃孵育30min后,流式细胞仪检测PG表面CD44和CD54表达情况。 胎儿脐静脉内皮细胞收集后,接种在96孔板上,然后加入已标记5,6-CFDA的PG细胞,实验组分别加入不同浓度的SQ,CO2培养箱中培养60min,再加入CD34-PE与粘附的细胞孵育30min,在荧光显微镜下检测PG与内皮细胞的粘附率。 收集PG细胞,加入已铺满内皮细胞的96孔板上,再加入不同浓度的SQ,CO2培养箱中培养60min,再以胰酶洗脱粘附的PG细胞,以CD44-FITC、CD54-FITC分别进行标记,流式细胞仪检测PG表面CD44和CD54表达情况。 将脂多糖(LPS)与内皮细胞于室温共孵育6小时,使内皮细胞充分激活,然后再按照上述方法进行PG细胞与内皮细胞细胞粘附实验以及SQ对两者粘附作用的影响。 2.结果 2.1 参杞合剂对PG细胞株体外作用的研究结果 三个浓度的SQ对PG细胞生长均有明显的直接杀伤作用,50μg/ml即可表现出明显的杀伤力。其杀伤强度在一定范围内呈现出对浓度和时间的依赖性。随着时间延长和浓度的增加,其杀伤作用逐渐增强。经不同浓度SQ作用72小时后,PG细胞S期细胞比率下降(32.3%至19.4%),细胞被阻滞于G0/G1期,G0/G1期比率逐渐增加(42.3%至63.5%)。将不同浓度SQ组与对照组相比,细胞增殖指数(PI)逐渐降低(56.4%至37.8%)。25μg/mlSQ组的PI与对照组相比,大致相同。50μg/ml和100μg/mlSQ组的PI明显 WP=6 低于对照组(P0.05)。 2.2 SQ对PG与血管内皮细胞粘附及粘附分子表达的影响 经不同浓度SQ作用72小时后,PG细胞表面粘附分子CD44、CD54的表达受到了明显的抑制。经统计学分析,与NS组相比,25μg/ml的SQ组PG细胞表面CD44、CD54的表达无显著性差异(P0.05),50μg/ml和100μg/ml的SQ组PG细胞表面CD44、CD54的表达有显著性差异(P0.05)。除了25μg/ml SQ组之外,与NS组相比,其他浓度的SQ对PG细胞与静息血管内皮细胞粘附率和粘附分子表达水平有明显的抑制作用,表现为剂量依赖关系,统计学分析有显著性意义(P0.05)。,激活的血管内皮细胞与PG细胞的粘附率及粘附分子表达水平都比静息的血管内皮细胞高,50μg/ml的SQ即可显示对上述过程的抑制作用。 3.结论 SQ在体外对PG细胞的生长有明显的抑制作用,对其与内皮细胞粘附及其表面粘附分子CD44、CD54表达也有明显的抑制作用。其作用机制可能是:①通过影响细胞周期,直接抑杀PG细胞;②通过抑制PG细胞表面粘附因子CD44、CD54表达来减少PG细胞与内皮细胞、基质细胞以及其他细胞的粘附,从而减少其对周围组织浸润的程度,达到抑制PG细胞发生转移的几率。为进一步开发具有多功能的抗肿瘤新药提供依据。


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