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IL-18 RGD模体的构建及生物活性的研究

卢忠民  
【摘要】:IL-18 熟称IFN-γ诱导因子,最初是从被痤疮丙酸杆菌感染和脂多糖攻击诱发的中毒性休克小鼠肝脏提取液中获得的,随后从上述小鼠肝细胞cDNA 文库中筛选到相应的基因。IL-18 基因分别编码193 个氨基酸和缺少公认的疏水信号肽的多肽前体,成熟IL-18 是由157 氨基酸组成分子量为18.3kD 的蛋白质, 从人肝细胞cDNA 文库中克隆出hIL-18cDNA,测序证实二者间至少有65%的同源性,在N 端都含有由35 个氨基酸组成的前导序列肽。 IL-18 是一多功能因子,能促进有T 细胞和NK 细胞介导的Th1 活性,与IL-2一起具有诱导IFN-γ的协同免疫性,调节其他免疫因子如TNF-、IL-1 等。IL-18被认为是一种很有潜力的抗肿瘤因子,鉴于对人的免疫性疾病和感染性疾病的作用,越来越引起人们的广泛重视 本文通过基因工程手段利用SOE 方法,对其进行改造,IL-18 第39 精氨酸残基和第40 天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD 模体,并将此突变的cDNA 片段构建于质粒pPIC9K,电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 中,进行分泌型表达,对表达产物进行用Sephadex G-100 凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白。对该纯化蛋白Western-blot 分析具有相同的灰度,说明选择的抗体与IL-18 识别位点不在RGD 位置附近。 为了检验突变后对IL18 原有的功能的影响,我们选择了表达产物体外诱导人PBMC 产生IFN-r 这一指标,结果显示,突变前后没有发生改变,说明我们构建RGD 模体的位点没有影响其原来的生物活性。 RGD 是粘附蛋白与细胞表面特异受体蛋白相互作用的识别位点,血小板膜上的糖蛋白GPⅡb-Ⅲα复合体是纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白的受体蛋白,同时也是最丰富的血小板细胞表面蛋白,在这些粘连蛋白与其他血小板膜受体识别


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