高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株差异表达基因的筛选和鉴定
【摘要】:背景:转移是区别肿瘤良恶性的主要生物学标志,也是恶性肿瘤患者最常见的死因。揭示肿瘤转移的分子机制、提高恶性肿瘤患者的预后是近年来肿瘤学研究领域面临的迫切问题。由于恶性肿瘤绝大多数来源于上皮,而淋巴道是其主要转移方式,因此,淋巴道转移分子机制的揭示对于临床肿瘤患者的诊治具有更为重要的现实意义。肿瘤转移的发生受到多种因素的调控,是多种生物分子和信号通路在时间和空间上复杂作用的结果,但传统的研究方法一次只能检测一个或几个基因,不仅费时、效率低,而且可比性亦较差。上世纪 90 年代中期发展起来的高通量的基因芯片技术可同时对数以万计的基因进行快速而准确的检测,有效避免和弥补了传统技术的不足,结果客观可信。其中的表达谱芯片是应用最为广泛的基因芯片,它是对细胞内mRNA逆转录后形成的cDNA进行检测。Hca-F和Hca-P是一对高度同源但淋巴道转移能力显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株,其中 Hca-F为高转移细胞株,在有正常免疫功能的 615 小鼠体内,其淋巴结转移率在 70%以上;Hca-P 细胞为低转移株,其淋巴结转移率低于 30%。两株细胞源于同一亲本,具有基本相同的遗传背景,两者的差异主要集中于转移表型上,其差异表达基因可能参与肿瘤淋巴道转移机制的调控。
目的:本研究采用表达谱芯片比较高、低淋巴道转移力小鼠肝癌腹水型细胞株 Hca-F 和 Hca-P 的基因表达谱,以筛选出与肿瘤淋巴道转移相关的基因,为进一步阐明肿瘤淋巴道转移的分子机制奠定实验基础。
方法:TRIzol 试剂分别提取 Hca-F 和 Hca-P 细胞的总 RNA,用 T7-Oligo(dT)24引物(5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(dT)24-3’ )反转录合成双链 cDNA,Phase Lock Gel(PLG)—酚/氯仿纯化后以两种细胞的 cDNA为模板,使用 Affymetrix 公司的 Enzo RNATranscript Labeling Kit 进行体外反转录,同时进行生物素标记,合成生物素化的 cRNA 探针。合成好的 cRNA 探针经片段
·2·
化处理(大小约在50-200bp之间)后,分别在Affymetrix 公司的专用设备Affymetrix
? Hybridization Oven 640 中与 Affymetrix GeneChip? MOE430A(包括 22,690 个
转录本,对应于约 14,500 个小鼠已知基因和 4,371 个 EST)杂交 16 小时,杂
交后的芯片经过洗脱、染色处理,使用 Affymetrix? G2500AgeneArray Scanner 对
杂交信号进行扫描,芯片扫描后获得的数据利用 Affymetrix? Microarray Suit
Software 5.0 计算和处理。在比较两张芯片的结果之前,先对每张芯片的数据进行
归一化处理。以 Signal Log Ratio(在两张芯片相比较时代表了一个转录本变化的
大小和方向)≥1.0 或≤?1.0(表明转录本的水平至少提高或降低 2 倍)和 Change
p-value(代表了两张不同的芯片之间一个探针对表达水平相同或不同的可能性)
≤0.05(表明实验组芯片表达水平高于对照组)作为筛选差异表达基因的标准,并
应用生物信息学对检测结果进行分析。为确保芯片检测质量,在与小鼠 MOE430A
芯片杂交前,cRNA 探针先与一张质量检测芯片“test chip”杂交,经过扫描和数
据处理后,证实 cRNA 探针的质量没有问题后再用它与小鼠 MOE430A 芯片杂交。
检测芯片内还设有β-actin 和 GAPDH 等看家基因对照,以及 bioB、bioC、bioD、
cre 和过饱和的生物素化的寡核苷酸 B2 等外加的阳性对照,以检测基因芯片的质
量。 采用分子信标探针,定量检测 Slc38a4、Cav 和 BC037006 等 3 个已知基因在
两种细胞中的表达,以验证基因芯片的结果。每个基因重复三次,取三次实验所
得 CT值的平均值,经过看家基因 GAPDH 校正后再进行比较。
结果:动物实验证明,实验所用 Hca-F 和 Hca-P 细胞具有稳定的淋巴结转移
能力,符合本实验对细胞模型的要求。cRNA 探针与“test chip”杂交后的扫描图
可见,图上方的“Genechip TEST3” 字样和四角的点及中央的“+”字均清晰可
见,整张扫描图内的点线分布较均匀,表明 cRNA 探针质量良好。基因芯片的检
测报告表明,这两张芯片的背景值和噪音值都很均匀;其中的看家基因对照β-actin
和 GAPDH 的 5′端和 3′端均被检测到且 5′端和 3′端的信号比值分别是 1.04、
0.83 和 1.47、0.80,均明显低于 3.0 的标准值;外加的阳性对照 bioB、bioC、bioD
和 cre 也被检测到且信号强度随着浓度由低到高呈现出由弱到强的趋势,表明基因
芯片质量良好,杂交及检测体系正常,芯片检测结果可信。在总共 22,690 个转
录本中,Hca-F 细胞检测到 12,048 个,占总转录本数的 53.1%;Hca-P 细胞检测
到 11,881 个,占总转录本数的 52.4%。进一步利用 Affymetrix 公司提供的分析软
件Affymetrix ? Microarray Suite Version 5.0对上述两个样品的芯片检测结果进行
分析,并根据筛选标准进行筛选。结果发现 Hca-F 与 Hca-P 细胞相比,在 14,500
个已知基因中,Hca-F 中表达上调的有 901 个(1,097 个转录本),占芯片中已知
基因的 6.2%,在 4,371 个 EST 中表达上调的有 129 个(157 个转录本,数据在本
文中未公布),占芯片中 EST 的 3%;Hca-P 中表达上调的已知基因和 EST 分别是
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1 |
李胜利,吴先盛,鲁树坤,刘明辉,胡建国;肝占位性病变超声多普勒鉴别诊断前瞻性研究[J];湖南医科大学学报;1994年01期 |
2 |
程留芳,黎力,汪鸿志;原发性肝癌经肝动脉化疗栓塞生存三年以上20例临床分析[J];中华肿瘤杂志;1994年03期 |
3 |
孔庆志,陈焕朝;中西医结合双途径给药治疗晚期肝癌24例[J];中西医结合肝病杂志;1994年03期 |
4 |
陆云飞,林进令,梁水庭,巫山,黎乐群,廖清华,沈康年,严济邦;原发性肝癌诊治方法变迁对术后疗效的影响(附418例分析)[J];癌症;1996年04期 |
5 |
范健,滕皋军,何仕成,郭金和,翁帼英;原发性肝癌的肝肿瘤动脉化疗栓塞[J];中华消化杂志;1996年06期 |
6 |
王万忠,王维屏,王家耀,杜德利;bcl-2蛋白在肝肿瘤组织的表达及意义[J];中华肝脏病杂志;1996年04期 |
7 |
张梅,廖玉珍;肝局灶性结节样增生的影像学诊断[J];中国医学影像学杂志;1996年02期 |
8 |
官泳松,陈清圣,卢武胜,谢晓东;肝癌的介入放射治疗[J];中华普通外科杂志;1997年03期 |
9 |
王玉民,吴乃武,徐永辉,张哲学,田景明,王树义;小肠平滑肌瘤术后肝转移介入治疗[J];世界华人消化杂志;1997年03期 |
10 |
刘海;冷冻疗法在肝肿瘤治疗中的作用[J];中国现代手术学杂志;1997年04期 |
11 |
郭伟剑,宋明志,于尔辛;肝动脉化疗灌注结合外放射治疗大肝癌30例分析[J];实用癌症杂志;1999年02期 |
12 |
王烈,许建华,姚和祥,曹贵松;中晚期肝癌术后介入治疗的价值[J];第二军医大学学报;2000年01期 |
13 |
王在国,杨治贵,文华长,颜海婴,丁福全,冯燮林,肖瑞君,刘光中;经埋置式给药装置肝肿瘤门静脉造影的价值[J];中华放射学杂志;2000年05期 |
14 |
覃建论;射频治疗肝癌的现状及进展[J];右江民族医学院学报;2003年01期 |
15 |
李晓勇,罗经伦,刘新江,曹玉文;肝癌合并静脉癌栓的外科治疗[J];中国误诊学杂志;2004年07期 |
16 |
康玉玲,王春兰,唐红霞;肝脏肿瘤破裂误诊为异位妊娠[J];临床误诊误治;2004年11期 |
17 |
叶国英,陈萍;肝癌介入治疗术后并发症的观察与护理[J];现代实用医学;2005年05期 |
18 |
刘鸿亚,金来明,王芝钧,傅志明,刘子由;原发性肝癌自发破裂31例手术治疗分析[J];中国基层医药;2005年09期 |
19 |
戴小波,王益华,吕翔;肝细胞癌病理学研究的新进展[J];临床与实验病理学杂志;2005年05期 |
20 |
冉飞武;李建彬;刘同海;陈延条;梁超前;于金明;;原发性肝癌单纯颅骨转移一例[J];中华肿瘤杂志;2005年12期 |
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