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半巢式聚合酶链反应快速诊断真菌性角膜炎

刘丽梅  
【摘要】:真菌性角膜炎是主要的致盲性眼病,尤其在发展中国家。在中国,过去十年里真菌性角膜炎的发病率上升明显。早期精确的诊断并给予合理的治疗是决定真菌性角膜炎预后的关键。目前,真菌性角膜炎的确诊依然依靠临床表现和传统实验室技术。但是这些常用实验室诊断方法(涂片镜检和真菌培养)存在很多局限性,例如灵敏性和特异性较差,易受主观因素和药物治疗的影响,为此,需要建立快速、特异、有效的诊断技术,例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。众所周知,应用真菌特异性引物配合 PCR 扩增技术诊断真菌性角膜炎比传统的实验室检查技术更加灵敏、快速、特异,但还没广泛应用于临床。扩增目的序列的选择是决定 PCR 特异性的关键,真菌核糖体RNA(rRNA)基因是公认的多拷贝高保守基因,存在于所有的真菌中,而存在于真菌 18SrDNA 和 5.8SrDNA 基因组之间、5.8SrDNA 和28SrDNA 基因组之间的基因间转录间隔区(intergenic transcribed spacerregions , ITS1 区、ITS2 区),具有真菌种属间差异性,因此,ITS/5.8SrDNA 区域是目前最理想的扩增序列。半巢式 PCR(seminestedPCR)包括两轮扩增过程,因此可以提高 PCR 技术的灵敏性和特异性,本实验的目的包括:1 应用半巢式 PCR 技术扩增真菌 ITS2/5.8SrDNA区来检测疑诊真菌性角膜炎患者角膜刮片中的真菌 DNA;2 比较半巢式 PCR 技术、涂片镜检和真菌培养诊断真菌性角膜炎的阳性率;3 评价半巢式 PCR 技术用于真菌性角膜炎临床诊断的可行性。 方法:应用半巢式 PCR 扩增 ITS2/5.8SrDNA 区域来检测标准真菌


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