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E1A激活基因阻遏子调控体外培养人VSMCs表型转换的机制研究

胡叶  
【摘要】:研究背景和目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖与迁移是导致动脉粥样硬化和血运重建后再狭窄等血管狭窄性损伤形成的重要原因。而血管损伤后 VSMCs 由分化表型转变为去分化表型的过程是细胞增殖和迁移的始动因素,也是增生性血管疾病的共同病理基础。E1A 激活基因阻遏子(cellular repressor ofE1A-stimulated genes, CREG)是新近从 Hela 细胞 cDNA 文库中克隆的转录调控相关基因。研究表明,CREG 蛋白与 6-磷酸甘露醇胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-like growth factorⅡ/mannose 6-phosphatereceptor,M6P/IGF2R)相关,在多种肿瘤细胞中发挥抑制增殖和促进分化的作用。先前报道本室建立的人胸廓内动脉 VSMCs 克隆株HITASY 在不同培养条件下可发生分化和去分化表型的相互逆转,应用差异显示 PCR 技术在分化表型 HITASY 中筛选到高表达差异性 CREG基因,提示其表达可能与 VSMCs 分化密切相关。我们先前的研究发现,CREG 基因能够诱导体外培养的大鼠 VSMCs SM α-actin 表达并促进细胞向分化表型转换。大鼠颈动脉拉伤实验亦证实,CREG 蛋白表达与血管损伤后再狭窄过程中 VSMCs 增殖能力呈负相关。这些提示 CREG基因具有促进分化、抑制增殖等促进 VSMCs 向分化表型转换的功能,但 CREG 基因在这一过程中的作用机制及该基因对 VSMCs 迁移的影响迄今尚未见报道。 ·2· 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 是丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶,由 3 个成员组成,即细胞外信号调节激 酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK),应激活化蛋白激 酶 JNK 和蛋白激酶 P38。MAPK 介导的信号转导途径是细胞内多种增 殖、分化、迁移等信息传递的共同通路,是细胞外信号引起细胞核反 应的会聚点。活化的 MAPK 通过转位进入胞核内,激活多种早期反应 的核内癌基因,如 fos、myc、jun 等,启动和促进与细胞增殖、分化有 关的蛋白质基因的转录和表达,引起细胞增殖、促进蛋白质和胶原的合 成等。最近有研究报道 CREG 蛋白可以作为 ERK 信号转导途径抑制剂 抑制心肌细胞增殖。本实验的目的是探讨 CREG 蛋白对 VSMCs 增殖 和迁移活性的影响及其作用机制。 实验方法:(1)构建载体:用亚克隆技术将 pGEX-4T-1(+)/CREG 中的CREG cDNA 经pVAX1质粒正向克隆至逆转录病毒载体pLNCX2; 同时,将 CREG cDNA 反向克隆至逆转录病毒载体 pLXSN,分别构建 正 义 CREG 载 体 pLNCX2( + )/CREG 和 反 义 CREG 载 体 pLXSN(-)/CREG,筛选阳性克隆送 TaKaRa 公司测序。(2)以带绿色 荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空载体 pLNCX(+)/GFP 为对 照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体感染 293 细胞,包装出 完整的逆转录病毒后,感染 HITASY。经 G418 筛选,获得稳定感染的 细胞克隆。(3)应用免疫荧光染色、Western blot 等方法检测感染 pLNCX2(+)/CREG 和 pLXSN(-)/CREG 后 HITASY 细胞 CREG 和平滑 肌分化标志蛋白 α-肌动蛋白(SM α-actin)表达,以探讨 CREG 对 HITASY 分化的影响(。4)应用 BrdU 染色的方法检测感染前后 HITASY 细胞增殖能力的改变,并通过 Western blot 等方法检测 ERK/MAPK 信 号转导通路的改变以探讨 CREG 对 HITASY 细胞增殖的影响及其作用 机制。(5)通过刮伤实验、慢速显微摄像技术观察感染前后 HITASY 的迁移能力,用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs) 的活性。同时通过 Western blot 等方法检测 MAPK 信号转导通路的改变以探讨 CREG 对 HITASY 迁移的影响及其 作用机制。 ·3· 实验结果:(1)将 CREG cDNA 经 pVAX1质粒正向克隆至逆转录 病毒载体 pLNCX2,反向克隆至逆转录病毒载体 pLXSN,转化 E.coli DH5α,用酶切鉴定筛选出阳性克隆,测序结果与 GenBANK 中报道的 CREG 序列比对完全一致。(2)将重组逆转录病毒载体用磷酸钙共沉 淀法分别感染 HITASY 后,以正常 HITASY 为对照,用 RT-PCR 检测 各组细胞 CREG mRNA 表达水平;用免疫荧光染色和蛋白质印迹分析 观察与空白对照组相比感染后的 HITASY 中 CREG 的表达。结果表明 pLNCX2(+)/CREG 和 pLXSN(-)/CREG 稳定感染的 HITASY 中均可见 约 670 bp 的扩增谱带,与空载体 pLNCX(+)/GFP 感染组及与空白对照 组相比明显增强。感染 pLNCX2(+)/CREG 的 HITASY 中 CREG 表达 明显上调;而感染 pLXSN(-)/CREG 的 HITASY 其 CREG 表达下调。(3) 为验证正、反义 CREG 对 HITASY 分化标志蛋白 SM α-actin 表达的影 响,用免疫荧光染色和蛋白质印迹分析观察到与空白对照组相比感染 pLNCX2(+)/CREG 的 HITASY 其 CREG、SM α-actin 表达明显上调; 而感染 pLXSN(-)/CREG 的 HITASY 其 CREG 和 SM α-actin 表达下调。 (4) 为验证正、反义 CREG 对 HITASY 增殖的影响,用 BrdU 染色观 察到与对照组相比稳定感染 pLNCX2(+)/CREG 的 HITASY 中 CREG 和 SM α-actin 蛋白表达上调同时细胞增殖能力减弱,而稳定感染 pLXSN(-)/CREG 的 HITASY 增殖能力明显增强。蛋白质印迹分析观察 到 CREG 过表达 ERK1/2 信号转导通路磷酸化被抑制,并且这一作用 可被 ERK1/2


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