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粘液放线菌菌毛对成纤维细胞表达IL-1β,IL-6,TNF-α的影响

李炜玲  
【摘要】: 粘液放线菌(Actinomyces viscosus)是导致牙周病患者牙周组织破坏的主要致病菌。研究表明,粘液放线菌菌毛促进了粘液放线菌与牙周组织的粘附,是引起牙周病病理变化的重要细胞结构。但是粘液放线菌菌毛的免疫学作用却未见报道。因此,探讨粘液放线菌菌毛对于某些与免疫有关的细胞因子的影响,对于阐明粘液放线菌在牙周病发病机理中所起的作用具有重要的理论意义。 目的:提取粘液放线菌菌毛,并检测这种促进粘液放线菌和牙周组织的粘附的细胞结构是否能引起成纤维细胞表达释放IL-1β,IL-6,TNF-α。 方法:首先用漩涡混匀器搅拌粘液放线菌悬液,然后采用低温高速离心分离,提取粘液放线菌菌毛。采用考马斯亮蓝法和蒽酮法测定菌毛中蛋白质和糖的含量,并进行氨基酸组成分析,结合电镜观察,以确定菌毛的纯度。将提取的粘液放线菌菌毛与小鼠成纤维细胞共培养,48h后收集细胞培养基,用Western-blotting的方法分别检测细胞培养基中IL-1β, IL-6,TNF-α的表达水平。 结果: 1.电镜结果: (1)厌氧培养48h后,粘液放线菌菌株19246表面存在菌毛。 (2)漩涡混匀器搅拌,结合低温高速离心处理后,粘液放线菌菌毛与菌体充分分离,得到菌毛粗提物。 2.菌毛的化学组成:粘液放线菌菌毛主要由大量的蛋白质和少量的糖组成,粘液放线菌菌毛包含大量的谷氨酸,甘氨酸,精氨酸;非极性氨基酸百分含量最高。 3.Western blotting结果: (1)将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用山羊抗小鼠TNF-а单克隆抗体及碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG多克隆抗体二抗进行检测。结果表明,菌毛处理过的细胞培养基中可检测到TNF-а,而未经菌毛处理的细胞培养基中未见TNF-а。 (2)将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,兔抗小鼠IL-1β单克隆抗体及碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG多克隆抗体二抗进行检测。结果表明,菌毛处理过的细胞培养基中可检测到IL-1β,而未经菌毛处理的细胞培养基中未 见IL-1β。 (3)将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用山羊抗小鼠IL-6多克隆抗体及碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG多克隆抗体二抗进行检测。结果表明,菌毛处理过的细胞培养基中可检测到IL-6,而未经菌毛处理的细胞培养基中未见IL-6。 结论: 1、建立漩涡混匀器结合低温高速离心的新方法充分分离粘液放线菌菌体和菌毛,得到菌毛粗提物。 2、粘液放线菌菌毛可以诱导成纤维细胞产生IL-1β、TNF-а、IL-6。


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