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利用RT-PCR方法进行风疹及麻疹病毒的临床检测及基因序列分析

时雪梅  
【摘要】: 风疹是一种通过呼吸道传染、由风疹病毒(RV)引起的急性发热出疹性传染病。虽然具自限性,但常出现流行或爆发,严重危害青少年的健康。且妇女在妊娠的前三个月感染RV后易引起胎儿先天性风疹综合征(CRS),导致流产、死产或胎儿畸形等。麻疹是由麻疹病毒(MV)引起的一种以发热呼吸道卡他和遍及全身斑丘疹为特征的急性病毒性传染病,亦是危害儿童生命健康极其严重的传染病之一。由于典型病例很难见到,从临床表现上MV与RV难以鉴别。传统用于RV及MV诊断的方法有病毒的分离培养法、血清IgM抗体检测等方法,但由于培养周期长、手续复杂、抗体之间存在交叉、受时间的限制等不足,常出现假阳性或假阴性,且不能看出病毒基因的变异情况。本研究采用RT-PCR与ELISA抗体检测相结合的方法进行病毒筛查,探讨RT-PCR方法的优势,并对阳性结果进行基因序列及系统发生树分析,研究大连地区RV及MV的基因型及变异情况,同时得到作为临床检测较好的标本类型。 材料和方法:1.收集59例临床疑似RV及MV患者的血液、尿液和唾液提取总RNA,利用试剂盒及特异性引物进行逆转录及巢式PCR反应,以PCR产物的电泳条带大小作为判断阳性结果的依据(以RV及MV质粒作为阳性对照)。2.对电泳结果阳性的PCR产物进行纯化及序列测定。3.ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。4.通过DNAStar软件对阳性结果与世界其他地区的序列进行系统发生树分析。 结果:1.59例标本中有3例(5.08%)巢式PCR产物的电泳结果出现约592bp大小的条带,与RV阳性对照质粒PCR产物的大小相同,判断为RV阳性。有2例(3.39%)巢式PCR产物电泳结果出现约547bp大小的条带,与MV阳性对照质粒PCR产物的大小相同,判断为MV阳性。2.以E1.3n、E1.4R为外围引物对PCR阳性的37~#、41~#、43~#标本测序,基因片断为592bp, 41~#的突变率为2.74%,符合率为97.26%;37~#的突变率为2.19%,符合率为97.81%;43~#的突变率为2.19%,符合率为97.81%。以n3、n4R为外围引物对PCR阳性的44~#、46~#标本测序,基因片断为547bp, 46~#的突变率为9.39%,符合率为90.61%;44~#的突变率为7.27%,符合率为92.73%。3.血清学检测结果:其中RV IgM抗体阳性5例,MV IgM抗体阳性8例,MV IgM抗体可疑阳性3例。4.RVMV-PCR阳性结果中血液为2份,尿液为0份,唾液为3份,一代培养细胞为2例。RVMV-ELISA阳性结果中血液为7份,尿液为3份,唾液为6份。5.有2例为MV RT-PCR阳性对应MV IgM抗体阳性,2例为RV RT-PCR阳性对应MV IgM抗体阳性,1例为RV RT-PCR阳性而未检测到抗体,5例为仅RV IgM抗体阳性而未检测到抗原,7例为仅MV IgM抗体阳性而未检测到抗原。6.系统发生树分析:本实验的3株风疹病毒E1糖蛋白编码基因与基因Ⅰ型代表株RA27核苷酸的同源性为96.9%~97.5%,与中国1980年分离的风疹病毒基因Ⅱ型代表株BRDⅡ的核苷酸同源性为91.8%~92.5%,其中SXM-37~#RV和SXM-43~#RV完全相同,与JUDITH关系最近,同源性为99.2%;SXM-41~#RV与RA27-3关系最近,同源性为99.2%。本实验的SXM-44~#MV与DL6China97n关系最近,同源性为99.3%;而SXM-46~#MV与hebei05-18关系最近,同源性为99.1%。 结论:1.本研究表明出疹早期(2-3天)应进行RT-PCR检测,特异性强,若阳性则不需检测抗体即可确诊;若RT-PCR阴性则在出疹2-15天检测抗体以确诊。RT-PCR方法可作为病毒性疾病早期快速诊断的有效方法,ELISA方法则可作为它的有利补充。但RV和MV抗体存在交叉反应,若要鉴别二者则需RT-PCR检测。2.RV E1膜蛋白和MV的N基因均较为稳定,可以作为RV和MVRT-PCR诊断的代表基因。3.血液和唾液作为RT-PCR检测的标本阳性率最高,应用ELISA方法检测,血液、唾液、尿液标本均可,但血液优于唾液,唾液优于尿液。4.系统发生树分析结果:本研究的3例RV阳性标本均属基因Ⅰ型。其中两株同属一个病毒来源,与阳性对照株关系最近,而另一株与标准疫苗株相似。5.本研究的2例MV阳性株均为H1型。其中1例与大连本地病毒株相似,而另1例与河北株相似,可能为输入株。


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