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水通道蛋白-1(AQP-1)在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及中药清胰汤对其影响的实验研究

高振明  
【摘要】: 背景及目的重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)发病急剧,病情凶险,早期即可合并急性肺损伤(acute lung injury,ALI)而导致死亡。SAP诱发ALI的发病机制复杂,以往的研究认为由于细胞因子和炎症介质的过度释放影响了肺微血管内皮细胞的通透性而导致了以肺水肿为主要病理特征的ALI。水通道蛋白-1(aquaporin-1,AQP-1)是广泛分布于肺微血管内皮细胞的一种细胞膜蛋白,与肺水的转运密切相关。目前的资料显示,AQP-1参与了多种肺水肿性疾病的病理过程,但是在SAP诱发ALI的发病机制中的作用尚未见报道。 由于SAP诱发ALI的机制复杂,故目前尚未有一种特效的治疗方法,目前多主张综合的个体化治疗方案。其中,中药清胰汤对胰腺炎的治疗已经取得了非常好的治疗效果,但对AQP-1在肺组织中表达的影响,却少见报道。本课题通过观察AQP-1在重症急性胰腺炎大鼠肺组织的表达和功能改变,以及中药清胰汤对其表达的影响,从新的角度探讨SAP诱发ALI的发病机制,为临床更好地治疗ALI提供理论依据。 方法 实验一:将健康Wistar大鼠随机分为2组,每组24只:假手术组(SHAM组),重症急性胰腺炎肺损伤组(ALI组)。以15g/L去氧胆酸钠溶液逆行注入胰胆管诱发ALI模型。SHAM组剖腹后只翻动胰腺,不注射药物。动物模型建立后,分别于术后4h、8h和12h每组各取8只大鼠进行实验。留取动脉、静脉血备用。计算肺干湿比。取肺组织切片进行病理检查。血气分析仪检测动脉血气分析。血清淀粉酶水平测定采用自动生化分析仪测定。RT-PCR检测肺组织AQP-1mRNA表达。免疫组化法检测肺组织中AQP-1的表达,每只大鼠取3张切片进行图象分析,求其平均灰度。Westernblot法检测肺组织AQP-1水平。 试验二:48只造模后的Wistar大鼠随机分为肺损伤组(ALI组)和地塞米松组(DEX组),每组24只。另取24只Wistar大鼠作为假手术组(SHAM组)。DEX组在造模后立即于股静脉注射地塞米松2mg/kg。动物模型建立后,分别于术后4h、8h和12h每组各取8只大鼠进行实验。留取动脉、静脉血备用。计算肺干湿比。取肺组织切片病理检查。血气分析仪检测动脉血气。血清淀粉酶水平测定采用自动生化分析仪测定。RT-PCR检测肺组织AQP-1mRNA表达。免疫组化法检测肺组织中AQP-1的表达,每只大鼠取3张切片进行图象分析,求其平均灰度。Western blot法检测肺组织AQP-1水平。采用放免法测定血清TNF-α水平测定。 试验三:32只Wistar大鼠随机分四组:假手术组(SHAM组),胰腺炎肺损伤组(ALI组)、地塞米松治疗组(DEX组)和清胰汤治疗组(QYT组),每组8只。ALI模型制备:以15g/L的去氧胆酸钠逆行注入胰胆管诱发胰腺炎肺损伤模型;SHAM组只在剖腹后翻动胰腺;DEX组在造模后立即于股静脉注射地塞米松2mg/kg;QYT组于造模后立即予清胰汤以1ml/100g灌胃。各组在造模后8小时剖杀,腹主动脉及下腔静脉采血,动脉血立即行血气分析,静脉血离心后血清置-70℃冰箱保存备用。计算肺干湿比。取肺组织切片病理检查。血气分析仪检测动脉血气。血清淀粉酶水平测定采用自动生化分析仪测定。免疫组化法检测肺组织中AQP-1的表达,每只大鼠取3张切片进行图象分析,求其平均灰度。采用放免法测定血清TNF-α水平测定。RT-PCR检测肺组织AQP-1mRNA表达。Western blot法检测肺组织AQP-1水平。 结果 1.实验一:与SHAM组相比,ALI模型组肺组织镜下表现为肺间质大量炎性细胞浸润,大部分肺泡间隔明显增宽,肺间质大量中性粒细胞浸润。ALI组肺湿/干重比明显增加,并随时间延长逐渐加重(P0.01),动脉血气提示血氧分压明显低于SHAM组(P0.01),血淀粉酶水平显著升高( P0.01)。SHAM组肺组织可见AQP-1mRNA表达,但ALI组AQP-1mRNA表达明显下调,并且随着时间延长,肺湿/干重比逐渐增加、血淀粉酶水平逐渐升高而下调趋于严重(P0.01)。免疫组化结果、Western blot结果提示ALI组肺组织AQP-1的蛋白表达较SHAM组明显下调(P0.01),与AQP-1mRNA表达结果相一致。 2.实验二:与血淀粉酶的升高、动脉血氧分压的下降、肺水肿的加重相对应,ALI组血清中TNF-α的水平随着时间延长逐渐升高。与ALI组相比,DEX组血清TNF-α明显减低,差异具有显著性(P0.05)。ALI组,随着TNF-α的升高,肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达逐渐下降,而DEX组肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达较ALI组明显上调(P0.05),提示肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达与血清TNF-α水平呈负的线性关系。 3.实验三:与实验一、二的结果一致,ALI组肺湿/干重比、血淀粉酶水平、TNF-α的升高水平较SHAM组具有显著差异(P0.01),肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达水平较SHAM组明显下调(P0.01)。而DEX组与QYT组肺湿/干重比、血淀粉酶水平、TNF-α的升高水平较ALI组显著下降(P0.05),肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达水平较ALI组明显上调(P0.05)。QYT组与DEX组相比,两组的各种检测数据相近。 结论 AQP-1是分布在肺微血管内皮细胞的一种细胞膜蛋白,其功能是参与肺水的快速转运,因此,AQP-1在肺组织中的表达水平与肺水转运,尤其是病理条件下的肺水转运是密切相关的。以往的实验已经证实AQP-1参与了多种肺水肿性疾病的病理过程。本实验一的结果提示,随着肺损伤的出现、肺水肿的加重,肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达水平明显下调,证实了AQP-1在肺组织中的表达与肺水肿的形成有关。AQP-1参与了重症急性胰腺炎诱发急性肺损伤的病理过程。SAP诱发ALI的发病机制复杂,目前的研究多认为由于炎症介质和细胞因子的过度释放,改变了肺微血管内皮细胞的通透性而发生肺水肿。其中TNF-α被视为最重要的炎症介质之一,其出现及水平的高低可作为判断SAP预后的标准。实验二的结果可见,ALI组血清TNF-α升高,AQP-1在肺组织中的表达下调,肺水肿加重。而DEX组,由于地塞米松抑制了TNF-α的过度释放,肺组织中AQP-1的表达上调,肺水肿随之减轻。TNF-α的水平与AQP-1的表达呈负相关,可能是TNF-α通过某种途径抑制了AQP-1的基因转录,从而影响了AQP-1在肺组织中的表达。实验二同时进一步证实了AQP-1参与了重症急性胰腺炎诱发急性肺损伤的病理过程。中药清胰汤治疗SAP诱发的ALI有显著效果,但作用机制不甚明确。 我们将中药清胰汤用于治疗SAP诱发的大鼠ALI,并设立阴性对照组(SHAM组)和阳性对照组(DEX组),通过观察中药清胰汤对肺组织AQP-1表达的影响探讨其治疗机制。结果表明,中药清胰汤可以明显减轻SAP大鼠ALI的程度,并通过抑制TNF-α的过度释放,上调肺组织AQP-1的mRNA表达和蛋白表达来达到治疗目的。因此我们推测,调节肺组织AQP-1的表达是中药清胰汤治疗SAP诱发大鼠ALI的重要机制。


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