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脂肪间充质干细胞的培养的实验研究

梁久龙  
【摘要】: 目的:建立兔脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法,鉴定并分析其生物学特性,并探索脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件方法:选用新西兰大白兔,无菌取出腹股沟脂肪,胶原酶法分离出兔脂肪干细胞,并进行体外培养,取2代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征,并绘制细胞生长曲线及倍增时间。比较了不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于脂肪来源干细胞体外培养的不同效果。结果:①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态:原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长,生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“s”形,倍增时间为55h。○3兔脂肪干细胞的成脂分化诱导,经油红染色的办法,其成脂分化的阳性率为65%○4采用0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化后发咸,在消化时间为1h时,2mg/ml组细胞总数最多,活细胞比率与其他组有统计学差异。在消化时间为2h时,细胞总数较1h各组均增加,同时,1mg/ml组、1.5mg/ml组和2mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比率1mg/ml组和1.5mg/ml组最高。采用5%、10%、15%、20%五种不同血清浓度培养后发现,15%和20%组生长特性最佳,明显优于另三组。 结论:本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定,增殖较快的特点。脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1mg/ml、消化时间2h、血清浓度15%是最佳的培养条件。 目的:对同一个体不同部位的脂肪组织来源的干细胞的含量和体外成脂诱导分化的能力进行比较,为来源脂肪的干细胞的进一步应用提供实验依据。 方法:采用胶原酶消化法提取50例临床美容整形患者4个部位(眶隔内、腹部皮下、腋窝皮下、四肢皮下)脂肪组织中的干细胞,体外进行细胞培养,绘制其生长曲线,进行成脂诱导分化。在对照培养基(含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)中培养的第l代源自脂肪的干细胞,以3×l0~5细胞/ml接种到35mm培养皿中,将对照培养基更换为成脂诱导培养基,进行成脂诱导,每周换液2次,以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周,分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红0染色,以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红0染色及阳性细胞记数,分别对来源于患者的4个不同部位的脂肪抽吸标本中源自脂肪的干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测,采用卡方检验对不同部位脂肪来源的干细胞的数量和细胞的成脂诱导分化率进行测定。 结果:①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果:从不同个体的每10mL脂肪组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同,从2.45xl0~7/l0mL-1.25×l0~7个/l0mL不等;但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力,获得的平均干细胞数目与年龄无关,而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红0染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大,分化为成脂细胞,细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴,多者可占整个细胞体积的80%-90%,细胞核缩小或偏于细胞的一侧,呈阳性;而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成,呈阴性。 结论:患者年龄越大,成脂分化率越低,且同一患者不同部位来源于脂肪组织中的脂肪干细胞在平均数量上没有差别,而在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时,在患者年龄和取材部位上应有所选择,进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。


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