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内膜基质细胞协同孕激素对HOXA11基因负调控机制的研究

和娟  
【摘要】: 研究背景:同源框基因(homebox gene HOX )是一类与胚胎发育和细胞分化相关的基因,其表达的蛋白质是一类转录调节因子,主要调控脊椎动物的体节分化和确定胚胎前后分化关系。HOX基因中都包含了一个由183个碱基对(bp)组成的、高度保守的同源框序列。HOXA11基因是HOX基因家族中的一员,在成年哺乳动物中, HOXA11基因主要表达于子宫和宫颈。近年国外有关研究报道显示: HOXA11基因在人的子宫发育和胚泡着床过程中都起着重要作用。 目前认为性激素对子宫内膜的多种调节作用主要通过HOX基因介导完成。HOX基因的异常表达与多种妇科疾病(不孕、流产、内膜异位及肿瘤)相关。本课题组已往的研究结果显示,HOXA11基因在人子宫内膜的表达随体内卵巢性激素水平不同而呈周期性变化,尤其在分泌中期,内膜腺上皮HOXA11的表达量明显降低以至消失。提示在体内孕激素对内膜腺上皮HOXA11基因起负调控作用。这种负调控作用与分泌中期内膜的分化、成熟以及子宫接受态(receptive state)的形成密切相关。然而,体外研究发现,当上皮细胞与基质细胞分离培养时,孕激素不能使上皮细胞HOXA11基因表达量下降,反而使其表达量增加,只有当上皮细胞与基质细胞共培养时,孕激素才使上皮细胞HOXA11基因表达量下降,且这种负调控作用可被孕激素受体拮抗剂(RU486)所抑制。进一步研究发现,内膜基质细胞产生的某种或某些孕激素依赖因子与内膜腺上皮细胞中的孕激素受体PR共同介导完成孕激素对内膜腺上皮HOXA11基因表达的负调控作用。但是,基质细胞产生何种孕激素依赖因子下调腺上皮HOXA11的表达,目前尚不清楚。 研究目的:探讨基质细胞产生的孕激素依赖因子是否与基质细胞HOXA11基因调控的下游基因表达产物有关。 实验方法:主要采用双链RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术将HOXA11小型干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转入原代培养的人子宫内膜基质细胞中,抑制内膜基质细胞HOXA11基因的表达,再将基质细胞培养液与内膜腺上皮细胞共培养,同时加入孕酮;用RT-PCR和Western-blot检测腺上皮细胞HOXA11表达情况,从而证明基质细胞产生的孕激素依赖因子是否与基质细胞HOXA11基因调控的下游基因表达产物有关。 实验结果:在原代培养的内膜基质细胞中加入HOXA11干扰试剂(Hs_HOXA11_4_HP siRNA)分别作用6、12、18、24、30小时后,结果显示,干扰试剂的干扰作用表现为瞬时性,以第12小时HOXA11mRNA表达量最低,干扰效率最高,达77.5%;而后干扰效率开始下降并逐渐消失。 将干扰试剂作用12小时的基质细胞培养液以30%浓度与内膜腺上皮细胞共培养并加入孕酮处理,半定量RT-PCR结果显示:腺上皮细胞HOXA11 mRNA表达量降低,其中以腺P组(加入经孕酮处理4小时的基质细胞培养液)和腺siP(加入HOXA11干扰试剂作用12小时、孕酮作用4小时的基质细胞培养液)降低最显著,明显低于对照组(P0.05);腺si组(加入HOXA11干扰试剂作用12小时的基质细胞培养液)和腺siRP组(加入HOXA11干扰试剂作用12小时、RU486作用6小时、孕酮作用4小时的基质细胞培养液)表达量相似,略低于对照组( P0.05 )。Western-blot结果与RT-PCR结果基本一致。 结论:1.干扰试剂Hs_HOXA11_4_HP siRNA对基质细胞HOXA11基因的表达抑制作用具有瞬时性;2.内膜基质细胞可产生某种或某些孕激素依赖因子参与孕激素对内膜腺上皮细胞HOXA11基因的负调控;3.基质细胞产生的孕激素依赖因子与HOXA11基因调控的下游基因表达产物无明确关系。


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