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TRPC6在足细胞的表达及其与足细胞损伤修复相关性研究

姚琴  
【摘要】: 目的:足细胞的裂孔隔膜(slit diaphragm, SD)是肾小球滤过屏障的关键组成部分,新近发现的裂孔隔膜蛋白[1,2]瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6, TRPC6)是一个非选择性阳离子通道蛋白,它与Nephrin、Podocin等重要的裂孔隔膜分子共同组成一个信号传导复合物(signaling complex)以维持足突及裂孔隔膜结构和功能的完整性。本文旨在探讨TRPC6蛋白在小鼠足细胞系MPC5(mouse podocyte clone 5,MPC5)的表达及其表达变化与足细胞损伤、修复的相关性。 方法: 1、条件永生型小鼠足细胞系MPC5培养:根据文献[3]将复苏MPC5细胞,于33℃中增殖培养,平均3~4天达80%以上融合传代。换于37℃中培养,10~14天分化为成熟,此时为分化态MPC5,用于实验; 2、通过反转录酶—聚合酶链反应( RT—PCR)、免疫蛋白印迹(Western blotting)检测TRPC6在分化态MPC5的表达; 3、TRPC6与足细胞骨架蛋白关系研究:将分化态MPC5分两组,正常对照组(组1)不做任何处理,细胞松解素处理组(组2)加细胞松解素D(cytochalasin D) (2.5μmol/mL)作用6小时,用Western blotting方法检测两组TRPC6的表达量; 4、TRPC6与足细胞损伤及修复研究:建立正常对照组,嘌呤霉素核苷酸(PAN)肾病足细胞模型组,地塞米松干预组(0.01μmol/L,7 d),卡托普利干预组(10μmol,12 h、24 h、48 h、72 h),全反式维甲酸(ATRA)干预组(0.2μmol,24 h、48 h、72 h、96 h、120 h),用Western blotting方法检测各组TRPC6的表达量。 结果: 1、MPC5细胞在33℃有γ-INF的培养液中生长,细胞体小而突起,细胞间排列紧密,呈鹅卵石样,部分区域有管腔样结构,足突样结构少见,平均3~4天即达到90%融合,在37℃无γ-INF条件培养下的足细胞较33℃的胞体透明,呈多角形,细胞间相对疏松,管腔样结构增多,生长速度明显减缓,3~4天后细胞即停止增殖,1周后大量星型细胞样细胞形成,树枝状的足突结构明显,细胞间可见足突互相接触,10~14天分化成熟; 2、在分化态MPC5检测到特异性的TRPC6基因的RT—PCR产物条带为181 bp,与所设计的PCR产物大小一致,测序结果与Genebank上的mRNA序列完全一致。Western blotting法检测到特异性的相对分子质量为110 KD的TRPC6蛋白条带; 3、细胞松解素D处理组(组2)的TRPC6蛋白表达量较正常对照组(组 1)显著增加(P 0.01); 4、TRPC6蛋白在PAN模型组表达量较正常对照组显著增加(P0.01); 5、三组药物干预组结果如下: (1)地塞米松干预组TRPC6蛋白表达量较正常对照组增加有统计学意义(P0.05),而较PAN模型组显著减少(P0.01); (2)TRPC6蛋白在卡托普利干预组的表达量较正常对照组增加有统计学意义(P0.05),较PAN模型组减少有统计学意义(P0.05),其中干预24 h组的表达量较PAN模型组减少幅度最大(P0.01),与正常对照组最接近。卡托普利干预组各组间比较,24 h较另外3组显著减少(P0.01); (3)TRPC6蛋白在ATRA干预组的表达量较正常对照组增加有统计学意义(P0.05),较PAN模型组减少有统计学意义(P0.05),其中干预72 h组的表达量较PAN模型组减少幅度最大(P0.01),与正常对照组最接近。ATRA干预组各组间比较,72 h较另外4组显著减少(P0.01)。 结论: 1、从mRNA水平及蛋白水平证实,在分化态MPC5能正常表达TRPC6基因和蛋白质。 2、TRPC6蛋白在细胞松解素D及PAN引起的足细胞损伤时其表达显著增加;而受损足细胞经地塞米松、卡托普利、ATRA干预治疗后,TRPC6蛋白表达均较受损时明显减少; 3、卡托普利和ATRA的干预治疗与TRPC6蛋白表达量存在时效性,作用效果最显著时间:卡托普利为24 h,ATRA为72 h。


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