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低氧诱导因子-1α介导鼠胚成骨细胞凋亡的实验研究

张振  
【摘要】: 目的:观察低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在化学诱导的低氧状态下培养的原代鼠胚成骨细胞中的表达变化,并初步探讨其与细胞凋亡之间的关系。 方法:1.应用改良的组织块法,在无菌条件下取妊娠19天的KM胎鼠颅骨,进行原代鼠胚成骨细胞的培养,并用“反复贴壁法”对细胞进行纯化,之后对传代第3代培养的细胞持续计数8天,最后用Microsoft Excel XP软件绘制细胞生长曲线,同时对已培养7天的第4代细胞应用钙-钴染色法检测细胞的碱性磷酸酶,进行成骨细胞鉴定。 2.取传代第3代培养的成骨细胞,以含125umol/L终浓度氯化钴的DMEM常规培养液培养不同时间,进行化学模拟缺氧状态,对低氧培养的细胞在倒置相差显微镜下观察细胞形态,并对细胞进行计数。将培养不同时间的成骨细胞分别设为0、1、3、5、7天缺氧组。同时,对常氧培养的第3代细胞设0、1、3、5、7天常氧组。 3.采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测低氧和常氧培养不同时间的成骨细胞HIF-1α以及参与细胞凋亡的关键基因Caspase-3与Bcl-2的表达变化。 4.应用免疫印迹(Western-blotting)方法分别检测了低氧和常氧培养下成骨细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达情况。 5.统计学处理:所有的实验都重复三次,实验数据以X±S表示,使用SPSS 12.0软件包进行单因素方差分析,以P0.01表示有统计学差异。 结果:1.经改良组织块法培养的成骨细胞,多呈短梭形、三角形或多角形,有较多突起,部分细长突起常跨越细胞与远处的细胞突起相连接;胞核呈圆形或椭圆形,居中或偏于一侧,轮廓清晰,可见1~3个核仁。从接种后的第1天开始,倒置显微镜下观察,细胞数量扩增较慢,为细胞生长适应期,以后细胞增长加速,第6天达到高潮,后增长速度逐渐减慢,细胞数量开始下降。第4代培养的细胞碱性磷酸酶(ALP)染色结果显示,细胞质内有黑色颗粒状物质,有少量分散在细胞周围。计数200个细胞,成骨细胞阳性率为95. 5%,阳性细胞多为梭形和鳞片形细胞,证实为成骨细胞。 2.经氯化钴处理后3天,细胞在形态学上可见细胞膜边界不清,细胞皱缩,胞质致密,核染色质边集;氯化钴处理后7天,可见细胞核裂解,胞质芽突并脱落,形成含核碎片和细胞器成分的膜包被凋亡小体。对氯化钴处理后细胞进行计数,可见细胞数量于第5天达到高峰,但远低于同一时间的常氧组,之后细胞数量迅速降低。 3.反转录聚合酶链反应( RT-PCR)检测各基因的表达变化:通过凝胶成像系统观察并经Lab-work软件分析可见,经氯化钴处理后,HIF-1α和Caspase-3mRNA的表达随时间的延长逐渐增加(P0.01),除第0天外,均高于常氧组(P0.01),而常氧组各时间段则无明显变化(P0.05);Bcl-2mRNA表达与前两者相反,随时间的延长呈逐渐降低(P 0.01),除第0天外,均低于常氧组(P0.01),常氧组各时间段则无明显变化(P0.05)。 4.免疫印迹(Western-blotting)检测各蛋白的表达变化:通过ECL ( enhanced chemi luminescence)显色观察结果并经Lab-work软件分析可见,经氯化钴处理后, Caspase-3蛋白的表达逐渐增加(P0.01),除第0天外,均高于常氧组(P0.01),而常氧组各时间段则无明显变化(P0.05);Bcl-2蛋白表达与前者相反,呈逐渐降低(P0.01),除第0天外,均低于常氧组(P0.01),常氧组各时间段则无明显变化(P0.05)。 结论:1.改良的组织块培养法结合了传统的组织块法和酶消化法的优点,可在较短时间内获得较多的成骨细胞,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。 2.氯化钴可以化学模拟低氧状态,促进成骨细胞发生凋亡,使成骨细胞表达大量的HIF-1α。 3.HIF-1α可能通过调节Caspase-3和Bcl-2的表达而促进成骨细胞凋亡,且这种促进作用与缺氧的时间有关。


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