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小鼠CD147糖基化位点突变体在小鼠肝细胞IAR20中的表达与生物学功能初步研究

金敏丽  
【摘要】: 目的: 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的不断发展,蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。 CD147是高度糖基化的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族的成员。CD147是细胞表面多功能糖蛋白,广泛表达于各种细胞中,如淋巴母细胞,炎症细胞,特别在肿瘤细胞高表达。CD147主要通过诱导基质金属蛋白酶活性参与组织重构,参与许多生理和病理过程,包括精子发生、受精、神经网络形成和发育、HIV感染和肿瘤转移。 CD147由2个胞外Ig结构域,1个跨膜结构域和1个胞内结构域组成。从CD147N端起,第一个胞外Ig结构域与MMPs诱导活性及CD147自身寡聚有关;第二个胞外Ig结构域与窖蛋白(Caveolin-1,Cav-1)存在相互作用。由于N-糖基化不同, CD147同时表现为高糖型CD147(HG-CD147,分子量40-66kDa)和低糖型CD147(LG-CD147,分子量32kDa)。有文献报道,N-糖基化对CD147的诱导活性起促进作用,但CD147糖基化的功能尚有待深入研究。 本文基于本实验室已构建的野生型CD147真核表达载体,利用快速PCR定点突变的方法,构建CD147糖基化位点突变的真核表达载体,并将其稳定表达于小鼠肝正常细胞IAR20中,观察CD147的糖基化对细胞的生物学功能的影响。 方法: 1.利用快速PCR定点突变的方法,构建CD147糖基化位点突变pcDNA3.1表达载体。 2.利用脂质体将野生型CD147及其糖基化位点突变体表达载体转染至小鼠肝正常细胞IAR20细胞上,以空表达载体做对照,经G418筛选及RT-PCR和Western blot分析,获得野生型CD147及其糖基化位点突变体稳定表达株。 3.利用MTT法检测稳定表达野生型CD147及其糖基化位点突变体对IAR20细胞增殖能力的影响;利用体外基质侵袭实验,观察检测稳定表达野生型CD147及其糖基化位点突变体对IAR20细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果: 1、限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建小鼠CD147糖基化位点突变真核表达载体pcDNA3.1/CD147(N154Q)和pcDNA3.1/ CD147(N44,154Q)。 2、Western blot和RT-PCR结果表明, pcDNA3.1/CD147WT ,pcDNA3.1/CD147N154Q和pcDNA3.1/CD147N44,190Q在小鼠肝正常细胞IAR20细胞中稳定表达野生型CD147和糖基化位点突变体CD147N154Q的分子量分别为44kDa和45kDa,糖基化位点突变体CD147N44,190Q表达为两条带,分子量分别为37kDa和42kDa。 3、与转染空载体和未转染细胞相比,稳定表达野生型CD147和糖基化位点突变体CD147N154Q的IAR20细胞增殖能力和迁移能力显著增强(p0.05),而稳定表达糖基化位点突变体CD147(N44,190Q)对IAR20细胞的增殖能力和迁移能力没有显著影响(p0.05)。 4、与转染空载体和未转染细胞相比,稳定表达野生型CD147、糖基化位点突变体CD147(N154Q)和CD147(N44,190Q)均不增加IAR20细胞侵袭能力。 结论: CD147的稳定表达促进小鼠肝正常细胞IAR20细胞的增殖和迁移,而CD147的这种促进作用与CD147糖基化程度有关。


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