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Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道转移力Hca-F细胞株的侵袭和运动能力

王绍清  
【摘要】: 背景:癌的侵袭与转移是癌细胞与宿主细胞、细胞外基质( extracellular matrix,ECM)之间一系列复杂的、多步骤的、多因素相互作用的动态过程。细胞骨架是横越在真核细胞细胞核和细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质,由微丝、微管及中间纤维组成;三者高度协调分布,与胞核、质膜、细胞器相连构成了细胞形态骨架和运动协调系统,以保持细胞的形态和行使运动功能,并对信号传递有重要意义。近年的研究发现,细胞骨架与细胞遗传物质的复制、传递、遗传信息的表达,即与细胞的分裂、分化、凋亡、癌变等细胞生理功能改变密切相关。Hca-F细胞和Hca-P细胞是一对来源于同一小鼠肝癌细胞克隆、淋巴道转移潜能显著不同、能够稳定传代的亚克隆细胞系。经615小鼠局部皮下注射后,均特异地向引流淋巴结转移。Hca-F细胞和Hca-P细胞分别为高淋巴结转移和低淋巴道转移细胞株,在615小鼠内淋巴结转移率分别大于70%和小于30%,是研究癌症淋巴道转移机制难得的细胞株模型。 本组前期利用基因芯片技术,比较Hca-F细胞和Hca-P细胞之间差异性基因的表达情况,其中gelsolin基因在Hca-F细胞中的表达是Hca-P细胞表达的21.9倍。然而蛋白质是生命活动的体现者,可以说是执行者;基因对性状的控制,是通过控制蛋白质的合成来实现的,因此基因的功能还需要在蛋白水平予以进一步检验和确认。所以我们又通过荧光差异双向凝胶电泳技术,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤淋巴道转移相关的蛋白质,gelsolin蛋白在Hca-F细胞中的表达是在Hca-P细胞表达的1.7倍,提示其在肝癌的淋巴道转移中发挥着一定的作用。肝癌的淋巴道转移是一个多基因多步骤的过程,研究gelsolin在淋巴道转移过程中的作用和地位,有利于研究肝癌淋巴道转移机制和治疗。 目的:1.从蛋白质水平上比较蛋白质组学筛出的差异蛋白gelsolin在淋巴道转移潜能不同小鼠肝癌细胞系中的表达。2.构建pSilencer-gelsolin-shRNA表达载体,稳定转染Hca-F细胞并获得gelsolin的表达水平稳定下调的Hca-F细胞株,同时建立稳定转染pSilencer-无关序列Hca-F细胞株作为对照。3.研究gelsolin在细胞内的表达和下调其在Hca-F细胞株的表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F在细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力方面的影响,由此确定gelsolin与小鼠肝癌细胞淋巴道转移潜能间的关系。 方法:1.采用细胞免疫组化、蛋白免疫印迹方法检测gelsolin蛋白在Hca-F、Hca-P细胞株中表达有无差异,为进一步研究肝癌淋巴道转移的机制奠定基础。2.依据GeneBank中小鼠gelsolin基因序列(序列登录号:NM_227753)合成三条shRNA的DNA模板的两条单链,分别命名为gelsolin1、gelsolin2、gelsolin3和gelsolin无关序列,将pSilencer ?3.1-H1neo质粒双酶切后分别与三条shRNA的DNA模板和无关序列的退火后产物连接,连接产物分别命名为pSilencer-shRNA-gelsolin-1、pSilencer-shRNA-gelsolin-2、pSilencer-shRNA-gelsolin-3、pSilencer- shRNA-wg。对三条pSilencer-shRNA表达载体经测序鉴定准确后(引物为5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'),将三条pSilencer-shRNA表达载体和无关序列对照组分别以脂质体法稳定转染Hca-F细胞,用含400μg/mlG418的完全培养基筛选,获得pSilencer-shRNA-gelsolin表达载体稳定转染的Hca-F细胞和无关序列对照组细胞。提取未处理的Hca-F细胞株、稳转pSilencer无关序列的Hca-F细胞株、稳pSilencer- gelsolin-shRNA三条表达载体的Hca-F细胞株的RNA、蛋白,RT-PCR和Western-Blotting检测shRNA转染后Hca-F细胞gelsolin在mRNA和蛋白质水平的表达。选出下调效果最好的一组细胞株用于后续实验。3.以三组细胞(分别为未处理的Hca-F细胞株、稳染了pSilencer无关序列的Hca-F细胞株、稳转pSilencer-shRNA-gelsolin-1表达载体的Hca-F细胞株)为实验对象。以CCK-8法检测三组细胞的细胞活力和分裂增殖能力;Transwell实验检测三组细胞的体外迁移能力(Transwell小室不做处理)、和侵袭能力(在Transwell上室中加人工基底膜);分别在615小鼠足垫内侧接种三组细胞,2×106个/0.05ml细胞,28天后观察各组淋巴结肿瘤转移情况。 结果:1.Gelsolin在小鼠腹水型肝癌细胞系Hca-F细胞和Hca-P细胞胞浆中表达,Western-blot分析显示gelsolin在Hca-F细胞中高表达,在Hca-P细胞中表达较低(P0.05)。2.经酶切电泳分析及DNA测序鉴定,成功构建三条重组质粒,并转入Hca-F细胞;与未作处理的Hca-F细胞相比三组重组质粒gelsolin在mRNA水平的抑制率分别为46.8%、48.2%、20%;在蛋白水平对gelsolin的抑制率分别为76.4%、50.4%、37.4%;其中pSilencer-gelsolin-shRNA-1稳定转染的Hca-F细胞株gelsolin下调效果最明显(P0.01),选择作为后续功能实验研究的gelsolin稳定下调的细胞株。3.CCK-8检测细胞增殖活性显示gelsolin不影响细胞的增殖;体外迁移实验,通过比较穿过膜的细胞在A570吸光值由Hca-F的(0.2480±0.0447)、对照组的(0.2239±0.0274)减少到干扰组细胞(0.1716±0.0232)(P0.05);体外侵袭实验,比较穿过人工基地膜Hca-F细胞(0.2007±0.0129)、对照组(0.2236±0.0446)和干扰组细胞(0.1557±0.0051),可以发现下调gelsolin蛋白表达后,干扰组细胞穿过人工基底膜的细胞A570 OD值吸光度值较对照降低(P0.05),结果显示下调Hca-F细胞中gelsolin的表达后,转移的肿瘤细胞数量减少,癌细胞的运动侵袭能力下降;体内淋巴结转移实验显示,下调gelsolin抑制了Hca-F细胞在小鼠体内淋巴结的转移率。 结论:1.Gelsolin在小鼠腹水型肝癌细胞系Hca-F和Hca-P均有表达,且Hca-F中较高,而在Hca-P中表达较低。2.利用pSilencer?3.1-H1neo质粒和shRNA成功构建了三个pSilencer-gelsolin-shRNA表达载体,该载体转染Hca-F细胞细胞后,经含有400μg/mlG418的完全培养基筛选,获得了稳定转染pSilencer-gelsolin-shRNA表达载体的Hca-F细胞株,在成功构建的shRNA稳定转染的Hca-F细胞中,其中pSilencer- gelsolin-shRNA-1对Hca-F细胞中gelsolin抑制效果最明显,作为后续研究的细胞株。3.Gelsolin具有增强肿瘤细胞迁移和侵袭的能力,抑制gelsolin基因和蛋白的表达,具有下调鼠源肝癌细胞转移和侵袭能力的作用,证明在肝癌的淋巴道转移过程中gelsolin发挥着重要的作用。


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