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血清中LeY糖抗原的测定及其临床意义

张士红  
【摘要】: 目的:路易斯抗原Y (Lewis antigen Y,LeY)是一种血型相关抗原,是结合于一些糖蛋白和糖脂末端的寡糖,在60-90%上皮来源的肿瘤中高表达,并与肿瘤的生长、转移等恶变程度密切相关。含LeY的糖蛋白或糖脂可分泌或脱落至血液中。本文目的是建立一种适合临床检验的血清学诊断方法,分析血清中LeY的表达情况,为临床肿瘤诊断提供依据。 方法:本实验拟建立的LeY在人血清中检测的方法如下: 一、病例选择 选择肿瘤患者血清169例,包括乳腺癌、卵巢癌,直肠癌、肺癌、胃癌和膀胱癌,以及正常人血清200例为阴性对照。 二、ELISA双抗夹心方法的建立 1.ELISA一般步骤 (1)小鼠抗人抗体BG-8包被;(2)3%BSA液封闭;(3)加入待检血清,并设置空白、阴性、阳性对照;(4)加入酶标荆豆凝集素UEA-1抗体;(5)加入底物显色;(6)加入终止液;(7)测定OD450nm值。 2.条件优化 (1) BG-8抗体稀释度的确定:将BG-8抗体稀释成1:2000、1:1000、1:500、1:200、1:100五个不同浓度,按ELISA步骤,对OD450nm值作图,确定最佳浓度。 (2)酶标凝集素最佳浓度测定:将酶标UEA-1配制成1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg,按照ELISA步骤,对OD450nm值作图,确定最佳浓度。 (3)阳性对照浓度的确定:将人子宫内膜移行上皮细胞癌细胞裂解液A431稀释成1:400、1:100、1:50、1:10、1:2五个浓度,按ELISA步骤,对OD450nm值作图,确定最佳浓度。 (4)反应时间的选择:按照ELISA步骤,改变各步反应时间,比较不同时间OD450nm值,确定适当的反应时间。 3.测定:按照已确定的条件用ELISA夹心法测定不同肿瘤患者血清LeY的OD450nm值。用Westen blot法分析正常血清组及病人组LeY糖蛋白表达谱。 结果:1.条件优化:确定包被一抗和酶标凝集素二抗的工作浓度分别为:1:500、2.5μg/ml;阳性对照A431细胞蛋白裂解液工作浓度为1:50。包被条件为4℃36小时;血清反应时间为2小时;封闭时间为1小时;显色时间为20分钟。2.结果分析:(1)正常人检测标准曲线的制作:以LeY标准品稀释为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml不同浓度作图,经回归分析做成标准曲线,回归系数r=0.966。将待测样品平均OD450nm值代入标准曲线回归方程,确定LeY含量。(2)将正常人和不同肿瘤患者之间测定值用Spss11.5进行统计学比较,分析线性关系及相关性。3.各组血清LeY测定结果为:乳腺癌:(156.81±46.93)ng/ml,卵巢癌:(176.90±50.71)ng/ml,直肠癌: (119.70±38.82)ng/ml ,肺癌: (55.58±35.02)ng/ml ,胃癌:(66.40±33.51)ng/ml,膀胱癌:(79.44±41.28)ng/ml,正常人:(35.17±22.49) ng/ml。实验组肿瘤血清LeY水平均明显高于正常组,差异具有统计学意义(p0.01);其中乳腺癌、卵巢癌组和直肠癌组与正常人组血清LeY水平差异较其他肿瘤组与正常人血清LeY水平差异更为明显。Westen blot法显示肿瘤组阳性条带检出率均高于正常组,乳腺癌、卵巢癌和直肠癌条带检出率显著高于其他癌组。 结论:1.所建立的ELISA夹心法具有灵敏、特异的特点,可用来检测血清中LeY寡糖抗原的表达。2.血清LeY水平在不同肿瘤中表达不同。在乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌、胃癌、膀胱癌肿瘤患者例数中,以乳腺癌、卵巢癌和直肠癌表达更为明显,对乳腺癌、卵巢癌和直肠癌临床诊断有意义。3. Westen blot法进一步分析与ELISA双抗夹心法定量测定方法显著性差异趋势一致。


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