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硒蛋白S基因表达与过氧化氢介导的ECV_(304)细胞损伤关系的研究

刘颖  
【摘要】: 目的:体外构建含shRNA的硒蛋白S(Selenoprotein S, SelS)基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒,将其瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中,将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组,以不同浓度的过氧化氢(H2O2)损伤后,观察各组细胞损伤前后的氧化应激指标及窖蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)、蛋白激酶Cα(PKCα)表达水平的差异,探讨SelS的作用是否通过PKC通路发挥作用,及此通路与Cav-1的关系,为研究内皮保护策略提供新的实验依据。 方法: 1.构建三条含shRNA的SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒,应用脂质体转染技术将质粒瞬时转染至ECV304细胞中,以GAPDH为内参照半定量检测SelS mRNA水平的表达,筛选有效干扰质粒。 2.将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组,以GAPDH为内参照,实时定量PCR方法检测SelS mRNA水平的表达;以β-actin为内参照,Western blot方法检测SelS蛋白水平的表达。 3.各组细胞分别经含有终浓度为0、400、600、800及1000μmol/L的H2O2的培养液作用6h后,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察H2O2对细胞增殖能力的影响;取不同浓度损伤的各组细胞上清液,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。 4.根据MTT结果,以H2O2浓度为800μmol/L的培养液作用各组细胞24h后,提取各组细胞总RNA及总蛋白,采用实时定量PCR方法检测各组细胞Cav-1及PKCαmRNA水平的表达;Western blot方法检测Cav-1及PKCα蛋白水平的表达。 结果: 1.成功构建SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒,而且设计的三条干扰质粒均可干扰内皮细胞中SelS基因的表达。实时定量PCR及Western blot证实SelS低表达组的SelS mRNA及蛋白表达水平均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组明显减低,未转染组与空载体转染组表达无差异(P0.05)。 2.细胞生存率(%):ECV304细胞暴露于含不同浓度的H2O2的培养液中6h后,细胞生存率明显下降;各浓度组的细胞生存率在SelS低表达组(84±2.0、69±1.0、60±1.5、42±1.5、23±2.0)均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组低(P0.01);在H2O2浓度为800、1000μmol/L时,SelS高表达组(71±1.5,63±2.6)的细胞生存率明显高于未转染组(64±0.5,45±2.6,P0.01)及空载体转染组(63±1.5,42±3.5,P0.01);空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P0.05)。 3.MDA含量(nmol/ml):各组细胞上清液中MDA的含量随着H2O2浓度的升高而增加;在H2O2浓度为600μmol/L时, SelS低表达组(6.52±0.16)的MDA水平高于SelS高表达组(3.69±0.16,P0.05);在H2O2浓度为800、1000μmol/L时, SelS低表达组(15.43±0.99,27.00±0.70)的MDA水平则高于未转染组(10.10±0.40,17.97±0.48,P0.05)及空载体转染组(9.50±0.46,16.60±0.80,P0.05);SelS高表达组的MDA水平在这三个浓度(3.69±0.16,6.24±0.51,10.41±0.35)均低于未转染组及空载体转染组(P0.05);H2O2浓度为1000μmol/L时差异更为显著(P0.01);空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P0.05)。 4.SOD活力(U/ml):各组细胞上清液中SOD的活力随着H2O2浓度的升高而减弱;在H2O2浓度为600、800、1000μmol/L时,SelS低表达组(6.62±0.53,5.09±1.65,3.48±0.88)的SOD活力则明显低于未转染组(7.52±0.29,5.70±0.22,4.62±2.33)及空载体转染组(7.12±1.63,6.10±1.78,5.00±1.27)(P0.05,P0.01,P0.01),在H2O2浓度800、1000μmol/L时减低更为明显(P0.01,P0.01);SelS高表达组的SOD活力(8.34±0.16、7.48±0.87、6.60±1.58)明显高于未转染组及空载体转染组,在H2O2浓度800、1000μmol/L时升高更为明显(P0.01,P0.01);空载体转染组与未转染组相比无差异(P0.05)。 5.Cav-1的表达:ECV304细胞暴露于含800μmol/L H2O2的培养液中24h后,Cav-1 mRNA表达在未转染组(1.56±0.07 vs 1.14±0.04,P0.01)、SelS高表达组(1.27±0.05 vs 0.85±0.25,P0.01)、空载体转染组(1.52±0.08 vs 0.93±0.05,P0.01)及SelS低表达组(2.84±0.07 vs 0.87±0.06,P0.01)均较损伤前明显升高;H2O2损伤后,SelS低表达组(2.84±0.07)明显高于未转染组(P0.01)、SelS高表达组(P0.01)及空载体转染组(P0.01),SelS高表达组(1.27±0.05)明显低于未转染组(1.56±0.07,P0.01)及空载体转染组(1.52±0.08,P0.01),而未转染组与空载体转染组比较无差异(P0.05)。H2O2损伤后与损伤前相比,Cav-1蛋白水平表达在未转染组(1.74±0.02 vs 1.25±0.01,P0.01)、SelS高表达组(1.45±0.04 vs 1.23±0.02,P0.01)、空载体转染组(1.79±0.04 vs 1.24±0.02,P0.01)及SelS低表达组(2.37±0.02 vs 1.26±0.15,P0.01)均明显升高;H2O2损伤后,SelS低表达组Caveolin-1蛋白表达(2.37±0.02)明显高于未转染组(P0.01)、SelS高表达组(P0.01)及空载体转染组(P0.01),而SelS高表达组(1.45±0.04)明显低于未转染组及空载体转染组(P0.01);而未转染组与空载体转染组比较无差异(P0.05)。 6. PKCα的表达:H2O2损伤后,SelS低表达组PKCαmRNA表达水平较损伤前升高(8.70±0.43 vs 3.11±0.13,P0.01);而未转染组(2.70±0.39 vs 2.59±0.22)、空载体转染组(2.98±0.64 vs 2.79±0.26)及SelS高表达组(2.74±0.55 vs 2.62±0.25)在损伤前后则无统计学差异(P0.05);H2O2损伤后PKCα蛋白水平表达在SelS低表达组较损伤前升高(0.63±0.04 vs 0.35±0.02,P0.01);而未转染组(0.35±0.02 vs 0.33±0.03)、空载体转染组(0.36±0.05 vs 0.35±0.03)及SelS高表达组(0.39±0.04vs0.37±0.04)在损伤前后则无统计学差异(P0.05)。 结论: 1.高表达SelS可以明显减弱H2O2对内皮细胞生长的抑制作用,减少氧化应激时MDA的生成,增强SOD活力,对内皮细胞具有保护作用。低表达SelS可以明显增强H2O2对内皮细胞生长的抑制作用,增加氧化应激时MDA的生成,减低SOD活力,加重内皮细胞损伤。 2. SelS保护ECV304细胞免于H2O2损伤作用可能通过PKCα通路发挥作用,并与Cav-1有关。


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