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褐藻多糖硫酸酯对人肺腺癌细胞系A549、SPCA-1增殖的影响

周欢欢  
【摘要】: 目的:褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan),又称为褐藻糖胶、岩藻聚糖硫酸酯、岩藻聚糖,是存在于所有褐藻中的细胞间多糖。它是一种水溶性杂多糖,除了主要成分L-岩藻糖和硫酸根外,还含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质等。本实验所用褐藻多糖硫酸酯由市售裙带菜(Undaria pinnatifida)中提取。研究表明,褐藻多糖硫酸酯具有多种生物学活性,包括较强的抗肿瘤活性,在体内、体外实验中,对多种肿瘤细胞均表现出明显的抑制增殖效应。具有广泛的研究和开发应用前景。大连地区,褐藻类裙带菜来源丰富、物美价廉、便于取材,具有明显的地域优势。目前,裙带菜仍然主要作为该地常见的食用藻类,有很大的开发利用和深加工的潜力和价值。 肺癌是现代社会中,随着环境压力的加剧,严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一。传统的肿瘤治疗均不可避免地对机体正常组织产生毒副作用。因此,寻找安全有效的抗肿瘤药物成为肿瘤治疗和药物开发领域急待解决的一个方向,对促进人类健康具有重要意义。研究表明,褐藻多糖硫酸酯对正常细胞的影响很小,安全性好,可望在肿瘤治疗中发挥作用。本文旨在探讨裙带菜中褐藻多糖硫酸酯对人肺腺癌细胞系A549.SPCA-1体外增殖的影响。 方法:1.采用乙醇分级沉淀法、三氯乙酸除蛋白法从市售裙带菜干粉中提取褐藻多糖硫酸酯;硫酸-苯酚法检测所提样品中的糖含量。 2.MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法检测褐藻多糖硫酸酯对A549及SPCA-1细胞增殖的抑制作用。 3.Hoechst33258染色检测经褐藻多糖硫酸酯处理后A549细胞是否发生凋亡的形态学改变;免疫细胞化学方法检测经处理后A549细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3.Caspase-9及核转录因子NF-kappa B的表达情况,并分别提取各组细胞的总蛋白,通过ELISA法对上述蛋白进行定量;流式细胞术检测褐藻多糖硫酸酯对SPCA-1细胞周期及凋亡的影响。 结果:1.提取所得多糖样品的平均得率约为6.20%,样品中平均糖含量约为40.84%,Fucoidan的平均提取率约为2.53%。 2.Fucoidan对A549细胞处理组与对照组间及不同浓度组间吸光度值均有显著差异(P0.05)。IC50反映当细胞存活率为50%时,对应的Fucoidan处理浓度。各处理时间组6h、12h、24h组IC 50分别为14.77 mg/ml, 8.46mg/ml,3.08mg/ml. Fucoidan对SPCA-1细胞12h、24h、48h、72h处理组组与对照组间及不同浓度组间吸光度值均有显著差异(P0.05)。各处理时间组,即12h、24h、48h、72h组IC50分别为19.18 mg/ml,9.58mg/ml,2.62mg/ml, 11.61mg/ml. 3.免疫细胞化学染色结果显示:Fucoidan呈时间剂量依赖方式上调调Caspase-3.Caspase-9蛋白的活性,伴随NF-kappa B转录因子的上调。 ELISA法结果显示:各处理组与对照组均有差异,P0.05,各处理组间呈剂量依赖性上调Caspase-3.9,呈剂量和时间依赖性下调NF-kappaB。而5mg/ml组对Caspase-3上调的时间依赖关系不显著,2.5mg/ml组对Caspase-9上调的时间依赖性不显著。 流式细胞术对Fucoidan处理的SPCA-1细胞检测的结果显示:Fucoidan具有诱导细胞凋亡的效应,经10mg/ml Fucoidan处理1 2h后,凋亡率达37.78%,处理24h凋亡率为18.4%。Fucoidan对细胞周期的影响结果显示:与对照组相比G2/M期细胞比例下降,12h对照组为9.16%,5mg/ml组为6.8%,10mg/ml组未检出G2/M期细胞。24h对照组为7.37%,5mg/ml组为0.38%,10mg/ml组为4.7%。 结论:1.综合分析选择、改良方法,降低了Fucoidan对细胞作用的IC50值。 2.Fucoidan对人肺腺癌细胞A549.SPCA-1均有增殖抑制作用。 3.Fucoidan对A549细胞的增殖抑制作用与其上调Caspase-3,9诱导细胞凋亡和下调NF-kappa B抑制细胞生长的效应有关。 Fucoidan对SPCA-1细胞的增殖抑制作用也与诱导细胞凋亡有关,同时由于可降低G2/M期细胞的百分比提示可能与对细胞周期的阻滞有关。


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