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牛磺酸金属衍生物影响大鼠感染创面VEGFA表达的实验研究

田曦亮  
【摘要】: 目的:研究牛磺酸金属衍生物的抗菌活性,及其对大鼠感染创面愈合过程中VEGFA表达的影响,并初步探讨其与创面愈合之间的关系及可能的机制。 方法: 1.通过多孔板-MTT比色法测定牛磺酸金属衍生物对金葡菌的最低抗菌浓度(MIC): 在洁净无菌的96孔板的每孔中加入浓度为106cfu/ml的金葡菌液90μl,药物孔分别加入用DMSO溶解的牛磺酸金属衍生物药液10μl,每孔药液的最终浓度分别为0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/ml。阴性对照孔加入DMSO10μl,每个药物浓度组设4个重复。 培养箱中暗培养24h后每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl显色。将显色的菌悬液离心,上清液转到另一多孔板中。在全自动酶标仪上以570nm波长测OD值,记录结果。 按下式计算药物抑制率(%):细菌抑制率70%则对该药为高度敏感(S),测得细菌抑制率70%的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。 2.选择健康雄性SD大鼠72只,体重200~220克,随机分为2组,即实验组(牛磺酸金属衍生物组)和对照组,每组各36只,单笼饲养。经10%水合氯醛腹腔内麻醉后,于背部中央剃毛,碘伏消毒。于每只大鼠背部同一位置用无菌手术刀制作1个直径1.5cm的圆形、急性全层皮肤缺损创面。在伤口表面覆盖用15×109·ml-1金黄色葡萄球菌1ml浸渍的边长为2cm的方形纱布,包扎伤口,外套钢丝网罩固定。1d后打开伤口,创口表面附有黄白色脓性分泌物,周围皮温略升高。创面感染模型造模成功。在实验组每个创面应用最低抑菌浓度的牛磺酸金属衍生物溶液1ml,对照组每个创面应用生理盐水1ml。每隔一天更换一次,直到创面完全愈合。 3.用药后每天观察两组大鼠的一般情况,包括其活动、进食、创面有无感染、化脓及肉芽组织生长等大体情况,并于用药后第1,3,7,10,14和21天,实验组和对照组分别随机选取6只大鼠处死,取两组大鼠的痂下组织行菌量测定。 4.于用药后第1,3,7,10,14和21天,根据画膜称重法分别测量实验组和对照组的创面面积。根据公式:创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%,计算两组不同时间段的创面愈合率。 5.以上时间点,切取创面组织,组织形态学(HE染色)观察创面组织,评价实验组和对照组创面愈合情况。 6.免疫组织化学观察不同时间点实验组和对照组创面血管内皮生长因子(VEGFA)的表达情况。 7.采用反转录聚合酶链反应(Rt-PCR)技术检测不同时间点实验组和对照组创面VEGFA mRNA的表达变化情况。 8.统计学处理:实验,数据用X±SD表示,采用SPSS 13.0软件进行数据分析,采用独立样本,检验比较两组间差异,以P0.05为有统计学意义,P0.01为有显著性差异。 结果:1.通过多孔板-MTT比色法测定牛磺酸金属衍生物对金葡菌的最低抗菌浓度(MIC)为4mg/ml。 2.用药后第1、3和14天实验组和对照组创面愈合率无显著性差异(P0.05):第7和10天牛磺酸金属衍生物组创面愈合率高于对照组(P0.05);至第21天,两组创面都完全愈合。 3.组织学检测创面愈合情况:用药后第1天,两组创面炎症反应均为较明显;用药后第3天,两组均可见新生肉芽组织、再生上皮及血管生成;用药后第7天,与对照组比较,实验组肉芽组织更成熟。用药后14天,实验组与对照组比较,胶原纤维排列整齐,瘢痕窄,胶原内可见再生的毛囊和皮脂腺。 4.免疫组织化学观察VEGFA的表达变化情况:在用药后第1,3,7,10,14和21天,实验组和对照组均可见VEGFA的表达,并且二者随着时间表达逐渐下降;在第3天实验组VEGFA的表达明显高于对照组(P0.01),第7、10天,VEGFA表达量下降,但实验组表达仍高于对照组(P0.05)。其余时间点实验组和对照组表达未见明显差异(P0.05)。 5.反转录聚合酶链反应(Rt-PCR)技术检测血管VEGFA mRNA的表达变化:在用药后第1,3,7,10,14和21天,实验组和对照组均可见VEGFA mRNA的表达,并且随着时间表达逐渐下降;在第3天实验组VEGFA mRNA的表达明显高于对照组(P0.05),其余时间点实验组和对照组表达未见明显差异(P0.05)。 结论:1.牛磺酸金属衍生物具有抗菌作用,其体外对金葡菌有的最低抑菌浓度(MIC)为4 mg/ml。 2.感染创面外用牛磺酸金属衍生物药液可以发挥有效的杀菌作用,促进创口缩小,提高创面愈合率,从而提高创面的愈合质量。 3.牛磺酸金属衍生物可以促进大鼠背部感染创面VEGFA的表达。 4.牛磺酸金属衍生物促进感染创面愈合的机制可能与其水溶液中持续、缓慢释放出的Cu2+产生的局部抗菌和促进创面血管生成作用有关。


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