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β-榄香烯乳放射增敏作用及其相关靶点基因筛选的研究

张卓  
【摘要】: 肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,放射治疗是中晚期肺癌治疗的重要手段。肿瘤细胞的放射敏感性是影响放疗疗效的重要原因。寻求高效低毒的放射增敏剂提高肿瘤细胞的放射敏感性,一直是人们努力追求的目标。研究发现一些放射增敏化合物虽然具有较好的放射增敏性,因其严重的毒副作用限制了在临床上的应用。近年来人们更多地关注中药的放射增敏研究。榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的非细胞毒性抗肿瘤药物,毒副作用小,具有放射增敏效应。既往关于p-榄香烯对肿瘤细胞的放射增敏作用机制的研究,主要集中在细胞周期改变及凋亡方面,而对其是否影响DNA双链损伤修复相关基因表达及放射增敏相关靶点基因的筛选未见报道。 本实验选用低细胞毒性的p-榄香烯乳联合照射,观察p-榄香烯乳对肺腺癌A549细胞放射增敏作用及其对细胞凋亡相关基因bcl-2、p53和DNA双链损伤修复相关基因Ku70、DNA-PKcs表达的影响。同时采用寡核苷酸基因表达谱芯片,检测p-榄香烯乳联合照射时A549细胞基因表达谱的变化,系统分析与细胞放射敏感性密切相关的功能基因,以进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏的分子机制,为中药β-榄香烯作为放射增敏剂的临床应用提供理论依据。 目的: 1、实验选用低浓度的p-榄香烯乳作用于肺腺癌A549细胞,通过克隆形成实验研究其对A549细胞的体外放射增敏作用;通过流式细胞仪观察细胞周期及凋亡的变化,RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2、p53的表达。 2、研究p-榄香烯乳联合照射对A549细胞DNA双链损伤修复基因DNA-PKcs、Ku70表达的影响,分析其与凋亡相关基因p53、bcl-2的表达的相关性,进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏的分子机制。 3、采用寡核苷酸微阵列芯片检测技术,全面检测p-榄香烯乳联合照射时A549细胞基因表达的变化,系统分析与细胞放射敏感性密切相关的功能基因及信号通路,以进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏作用的分子靶点及相关分子机制,为中药放射增敏剂的临床应用提供理论依据。 方法: 第一部分:细胞克隆形成率、细胞周期及凋亡的检测 1、取对数生长期的A549细胞进行MTT实验,检测β-榄香烯乳对A549细胞24 h的IC50值。 2、选取10% IC50浓度的β-榄香烯乳(0.1×IC50)、20%IC50浓度的β-榄香烯乳(0.2×IC50)分别作用A549细胞24h后,克隆形成实验观察不同剂量照射后细胞存活分数,拟合细胞存活曲线,求得D0、Dq及SF2值,由D0、Dq值计算放射增敏比SERD0、SERDq。 3、实验分为:①对照组(C)②单纯照射组(R):4 Gy射线照射③0.1×IC50组:即给予10%IC50浓度的β-榄香烯乳④0.2×IC50组:即给予20%IC50浓度的β-榄香烯乳⑤0.1×IC50+R组:即10%IC50浓度的β-榄香烯乳作用细胞24 h后给予4 Gy照射⑥0.2×IC50+R组:即20%IC50浓度的β-榄香烯乳作用细胞24 h后给予4 Gy射线照射。细胞经上述处理后24 h,荧光显微镜下观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR及Western blot检测p53、bcl-2基因的表达量。 第二部分:DNA双链损伤修复基因与凋亡基因的相关性检测 实验分组同第一部分,A549细胞经相应处理,24 h后RT-PCR及Western blot检测Ku70、DNA-PKcs基因mRNA及蛋白的相对表达量,并分析0.1×IC50+R组Ku70、DNA-PKcs基因与p53、bcl-2基因表达的相关性。 第三部分:寡核苷酸基因芯片对放射增敏靶点基因的检测 1、提取0.1×IC50+R组及单纯照射R组细胞总RNA,纯化mRNA, Chip-on-lab电泳及琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性,逆转录mRNA合成cDNA探针,Cy5/Cy3标记,在含有30968个基因的人全基因组寡核苷酸芯片上杂交,扫描芯片荧光信号图像,图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。 2、选取芯片检测结果中明显上调及下调基因各一个进行RT-PCR验证,以确定芯片检测结果的可靠性。 结果: 第一部分 1、细胞生长抑制作用不同浓度的β-榄香烯乳作用于A549细胞,对细胞增殖均有抑制作用,随着β-榄香烯乳浓度的逐渐增加,细胞抑制率逐渐增大。β-榄香烯乳作用A549细胞24h的IC50值为120μg/ml。 2、放射增敏作用在相同β-榄香烯乳浓度下,随着照射剂量的增加,A549细胞存活分数逐渐减少。相同的照射剂量下,随着β-榄香烯乳浓度的增加,细胞存活分数逐渐降低。 从细胞生存曲线,求得C组、0.1×IC50组、0.2×IC50组D0值分别为2.45±0.24Gy、1.64±0.15 Gy、1.55±0.13 Gy;Dq值分别为2.68±0.25 Gy、1.87±0.22 Gy、1.53±0.11 Gy,SF2值分别为84.6+20.9%、56.3±14.9%、43.2±10.7%。从细胞生存曲线可以看出,随β-榄香烯乳浓度的增加,细胞生存曲线向左侧移动,肩区变小,直线部分斜率增大,D0、Dq及SF2值逐渐减小。求得0.1×IC50组β-榄香烯乳的放射增敏比SERDo及SERDq的值为1.54±0.20、1.43±0.15;0.2×IC50组β-榄香烯乳的放射增敏比SERDo及SERDq的值为1.63±0.32、1.75±0.19,随着β-榄香烯乳浓度的增加,SER值逐渐增大。 3、细胞周期:与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞的G2/M期比率变化不明显(P0.05);与R组相比,0.1×IC50+R组及0.2×IC50+R组细胞的G2/M期比率明显增加(P0.01);且随着药物浓度的增加,细胞G2/M期比率逐渐增加。 4细胞凋亡:与对照组相比,R组细胞凋亡率有所增加,但差别无统计学意义(P0.05);0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞的凋亡率无明显变化(P0.05);与R组相比,0.1×IC50+R及0.2xIC50+R组细胞凋亡率明显增加(P0.01),呈现特征性的亚二倍体峰(凋亡峰),且随着药物浓度的增加,凋亡率逐渐增多。荧光显微镜下可以看到0.1×IC50+R及0.2×IC50+R组细胞凋亡数目较R组明显增多。 5、bcl-2表达:与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞bcl-2mRNA相对表达量较对照组无明显变化(P0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P0.05)。Westernblot检测结果分析bcl-2蛋白表达呈现相同趋势。 6、p53表达:与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞p53 mRNA相对表达量较对照组无明显变化(P0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组p53mRNA表达量较单纯照射组明显增加,差别有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果分析p53蛋白表达呈现相同趋势。 第二部分 1、Ku70表达:与对照组相比,R组细胞Ku70 mRNA相对表达量较对照组略有升高(P0.05)。0.1×IC50组、0.2×IC50组Ku70 mRNA相对表达量与对照组相比无明显变化(P0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果分析Ku70蛋白表达呈现相同趋势。 2、DNA-PKcs表达:R组A549细胞DNA-PKcs mRNA相对表达量较对照组略有升高,但差别无统计学意义(P0.05)。0.1×IC50组、0.2×IC50组mRNA相对表达量与对照组相比无明显变化(P0.05)。但0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P0.05)。DNA-PKcs蛋白表达变化呈现相同趋势。 3、DNA双链损伤修复基因与凋亡基因的关系:对0.1×IC5o+R组各基因mRNA表达量进行Spearman相关分析,结果如下:Ku70与p53、DNA-PKcs与p53表达呈显著负相关(rKu70-p53=-0.758,P=0.024;rDNA-PKcs-p53=-0.665,P=0.037);Ku70与bcl-2、DNA-PKcs与bcl-2表达呈显著正相关(rKu70-bcl.2=0.847,P=0.013;r DNA-PKcs-bcl-2=0.861,P=0.010)。 对各基因蛋白表达相关性分析,结果如下:Ku70与p53、DNA-PKcs与p53表达显著负相关(rKu70-p53=-0.692,P=0.033;rDNA-PKcs-p53=-0.569,P=0.040),Ku70与bcl-2、DNA-PKcs与bcl-2表达显著正相关(rKu70-bcl-2=0.847,P=0.008;rDNA-PKcs-bcl-2=0.755,P=0.012)。 第三部分 1、Chip-on-lab电泳及琼脂糖凝胶电泳检测两组细胞RNA纯度和完整性良好。 2、Cy5/Cy3荧光信号值构建的散点图显示两张芯片重复性系数R为0.95,接近于1,提示芯片重复性较好。 3、共筛选出122条差异表达基因,其中89条基因显著表达上调,33条基因显著表达下调。这些差异表达基因主要参与DNA损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、信号转导与转录、细胞粘附、免疫反应等生物学过程。 4、RT-PCR结果显示,在基因芯片中上调表达的Egr-1基因,0.1×IC50+R组mRNA表达量明显高于R组;基因芯片中下调表达的CyclinD1基因,0.1×IC5o+R组mRNA表达量明显低于R组。 结论: 第一部分:放射增敏疗效与细胞周期和凋亡的关系 1、低浓度的β-榄香烯乳对A549细胞有放射增敏作用,10μg/ml和:20μg/mlβ-榄香烯乳的放射增敏比SERDo值为1.547和1.643;SERDq值分别为1.435和1.753。随着β-榄香烯乳浓度增加,放射增敏比逐渐增高,放射增敏作用逐渐增强。 2、p-榄香烯乳联合照射可显著影响A549细胞周期分布,促使细胞G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡。随着p-榄香烯乳浓度的增加,G2/M期细胞比率及凋亡率逐渐增加。诱导细胞G2/M期阻滞及凋亡是p-榄香烯乳放射增敏的作用机制之一。 3、p-榄香烯乳联合照射可下调A549细胞bcl-2基因及上调p53基因表达,促进细胞凋亡。随着p-榄香烯乳浓度增加,促凋亡作用逐渐增强。 第二部分:DNA双链损伤修复与凋亡基因的关系 1、p-榄香烯乳联合照射可抑制DNA双链损伤修复基因Ku70、DNA-PKcs表达,使A549细胞放射敏感性增加。 2、β-榄香烯乳联合照射组A549细胞DNA-PKcs、Ku70表达与p53表达呈显著负相关,与bcl-2表达显著正相关。 3、β-榄香烯乳影响DNA双链损伤修复途径的同时,也影响细胞凋亡途径,两因素相互影响,共同作用,增强A549细胞放射敏感性。 第三部分:放射增敏作用靶点基因的筛选 1、共有122条显著差异表达基因与p-榄香烯乳增加A549细胞放射敏感性与有关,这些差异表达基因主要参与DNA损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、信号转导与转录、细胞粘附、免疫反应等生物学过程。 2、β-榄香烯乳对A549细胞放射增敏机制为复杂的、多基因协同作用的结果。


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